Способ определения активности калпаинов в биологическом материале

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ 166895 ЕСПУБЛИК 01 й 33/ щыюеФ САНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ СВИДЕТЕЛЬСТВУ АВТОРСК(54) СПОСОБ ОПРЕДЕСТИ КАЛПАИНОВ ВМАТЕ РИАЛ Е кии институт и а и В.Д. Тавинцев о, 148, р, 413 - 423, ЕНИЯ АКТИВНО- ИОЛОГИЧЕСКОМ и ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР Изобретение относится к медицине, а именно к способам определения активности ферментов, и может быть использовано в клинической практике и для исследовательских работ при изучении различных физиологических и патологических состояний организма человека и животных.Цель изобретения - упрощение и ускорение способа за счет возможности многократного использования носителя.Способ поясняется примерами.П р и м е р 1, Определение активности калпаинов в сердечной мышце.Сердце крыс гомогенизируют в 8 объемах 20 мМ трис-НС буфера рН 7,66, содержащего 4 мМ динатриевой соли. этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), и центрифугируют при 25000 9 в течение 30 мин, К полученному супернатанту добавляют раствор хлорида натрия до конечной концентрации 0,25 М и наносят на колонку с октил-сефарозой СВ (0,9 х 3 см), предварительно уравновешенную буфером А (20 мМ трис-НС, 0,25 М йаС, 4 мМ ЭЛТА, рН 7,0). Балластные бел(57) Изобретение относится к биохимии. Цель изобретения - упрощение и ускорение способа. Эта цель достигается тем, что после центрифугирования тканевого гомогената или гемолизата эритроцитов проводят гидрофобное связывание супернатанта с октилсефарозой С=4 В, отмывают балластные белки и элюируют калпаины 0,5-ным раствором холата натрия. Активность.фермента определяют, используя в качестве субстрата казвин, 1.табл,ки отмывают буфером А. Для элюции калпаинов используют буфер В рН 8,0, содержащий 20 мМ трис-НС, 4 мМ ЭНТА и 0,50 ь хлората натрия. Рабочая скорость 30 мл/ч, объем активной фракции равен 1,5 мл,В инкубационную смесь, содержащую 0,250 щелочно-денатурированного казеина, 20 мМ трис-НС, 5 мМ 2-меркаптоэтанола,. рН 7,5, добавляют раствор хлорида кальция до конечной концентрации 2 мМ и выдерживают в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем добавляют 0,4 мл раствора калпаинов и инкубируют при 30 С 30 мин. Реакцию останавливают добавлением 1,5 мл холодной 80,-ной трихлоруксусной кислоты, Смесь центрифугируют при 3000 об/мин 15 мин. Надосадочную жидкость спектрофотометрируют при длине волны 280 нм против контроля, содержащего вместо хлорида кальция 2 мМ ЭДТА.П р и м е р 2. Определение активности калпаина( в эритроцитахОтбирают кровь, используя в качестве антикоагулянта 3-ный раствор ЭДТА,1668950 Составител ь А.АгуреевТехред М,Моргентал Корректор М,Кучерявая Редактор И.Шулла Тираж Подписноеарственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ С 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 каз 2654 ВНИИПИ водственно-издательский комбинат "Патент" город, ул.Гагарина, 101центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин.Эритроциты промывают три раза 0,9 ф-ным раствором хлорида натрия с 2 мМ ЭДТА.Для гемолиза используют буфер следующего состава. 20 мМ трис-НС 1; 2 мМ ЭДТА, рН 5 7,5, который добавляют к эритроцитам в , соотноаении 1:9 и выдерживают в холо, дильнике 15 мин, Затем гемолизат центри фугируют 40 мин при 16000 д и далее , используют супернатант, с которым проводят операции по примеру 1. Конечная концентрация хлорида кальция в инкубационной смеси 1 мМ. Способ дает возможность проводить 15массовые определения при исследова; тельской работе и в клинике вследствиеупрощения техники определения ее удещевления при высокой точности и достаточной чувствительности, 20В таблице представлены данные , сравнительного анализа известного и , предлагаемого способов по чувствительно сти и точности.25 В известном способе эа единицу активности принимается количество фермента, увеличивающее абсорбцию на 1 ед при 595 нм после 30 мин инкубации при 25 С. В предлагаемом способе активность калпаинов выражена в мкмоль тирозинамг белФормула изобретения Способ определения активности калпаинов в биологическом материале путем измельчения материала, центрифугирования, помещения супернатанта на хроматографическую колонну, с последующей элюцией калпаинов, инкубацией элюата с субстратом и измерением содержания продуктов гидро- лиза, отл и ч а ю щи й с я тем, что, с целью упрощения и ускорения способа за счет возможности многократного использования носителя, в качестве носителя в кол о н ке используют октилсефарозу С 1;4 В, элюцию проводят 0,5;-ным раствором холата натрия, при этом связывание калпаинов с носителем проводят при рН 7,0, а элюцию - при рН 8,0,