Способ определения аденозинтрифосфата

) 4 О 01 И 33/5 АНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ А ВТОРСИОМУ ТЕЛЬСТ ологии и проором(33)ель изобретети способа заствительности ет повышения его Иммуниз произво т животных конь-диаденози вороточным ата им с мую ном. Попуч руют с ана ствии г-ил антисыворой проб1 Р АТФ,адный АТФм угле, ияют количванием калнного по емо(33 лизиру и у - - и своб св яз анныина активстраном. ван дел ользо строе робе с ис рафика, г талонным нием АТФ 10%оль/мл И ГОСУДАРСТВЕННЫИ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИ(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологиии Хозрасчетное опытное предприятие"Радиопрепарат" Института ядерной фияики АН УЗССР(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДЕНОЗИНТРИФОСФАТА(57) Изобретение относится к иммуно, анализу биологически активных веществ и может найти применение в био химии, молекулярной бизводстве меченых фоаденозинтрифосфатов.ния - повышение точно обам с известным содержавствительность способа 5 югатомнтетрафос- альбумитку инкубий в присутразделяют адсорбцией крытом декство АТФ в ибровочногоИзобретение относится к области иммуноанализа биологически активныхвеществ и может найти применение вбиохимии, молекулярной биологии и впроизводстве меченых фосфором(33)5аденозинтрифосфатов,Целью изобретения является повышение точности способа за счет повышения чувствительности способа. 1 ОП р и м е р 1, Получение коньюгата антигена с бычьим сывороточнымальбумином.8-Вг АДФ и гексаметилендиамин АДФполучают следующим образом, 15500 мг динатриевой соли АДФ в10 мл 1 М Ба-ацетатного буфера (рН4,3) обрабатывают избытком Вг в течение 40 мин. Избыток Вг экстраги"руют хлороформом, а для удаления остатков Вг водный раствор обрабатывают 2 мг метабисульфита натрия. Продукт осаждают добавлением 3-4 объемов этилового спирта при -20 С. Осадок отфильтровывают и промывают охлаж 25денным спиртом, растворяют в 10 млводы и добавляют 2 г гексаметилен-.диамина. Смесь нагревают при 60-70ов течение 2,5-3 ч. Для освожденияот избытка гексаметилендиамина продукт осаждают спиртом. Осадок промывают центрифугированием, растворяют в воде и хроматографируют наДЭАЭ-сефадексе Ав аммонийбикарбонатном буферном растворе, рН 7,5,Для получения модифицированного5, 5 -диаденозинтетрафосфата(РАрА) гексаметилендиаминовое производное АДФ вводят в реакцию кон"денсации с активированным АДФ,4 О0,06 моль триэтиламмонийной соли5-АДФ сушат упариванием 3 мл безводного ацетонитрила, растворяют в1,2 мл смеси диметилсульфоксид -этиловый спирт (1:1 по объему) идобавляют 0,3 ммоль 4-диметиламинопиридина, 0,24 ммоль трифенилфосфина, 0,24 ммоль дипиридилдисульфида(РУБ)Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 20 мин( смесь 1 ) Выход 4-диметиламинопиридиниевого производного определяютТСХ на Кеве 1 яе 1 ОО, Р, предварительно разбавляя аликвоту реакционной смеси 107-ным раствором пиперидина в этиловом спирте и анализируяполучающийся устойчивый пиперидидАДФ, НГ АДФ,05, ВГ пиперидидаАДФ,3,Отдельно высушивают 0,077 ммольтриэтиламмонийной соли 8-(б-аминогексаметилен)-аминоаденозин-дифосфата добавлением и упариваниемЗх 1 мл ацетонитрила, растворяют в800 мкл безводного диметилсульфоксида, переносят в смесь 1, упариваютэтиловый спирт и проводят реакциюпри 40 С в течение 2 ч, К смеси дообавляют 10 мл смеси вода-диметнлсульфоксид (1:1) и наносят на колонку сПЭИ-целлюлозой НСО -форма,(30020 мм)Колонку промывают 50 мл смеси водадиметилсульфоксид (1:1), 50 мл воды,и вьделение продукта проводят в градиенте концентрации ТЭАБ от С до0,5 М (объем раствора 800 мл, скорость элюции 40 мл/ч, объем фракций15 мл), Выход продукта составляет657 относительно исходного АДФ, Полученный продукт по времени элюцииионообменной смолы, устойчивости кщелочной фосфатазе, соотношению основание:фосфат (1:2) и спектральнымхарактеристикам в УФ-свете (Вмщс=267 нм "мин 236 нмЕ 290= 0,58) соответствует гексаметилендиаминовому производному АрА.Конъюгирование полученного соединения с БСА проводят по известнойметодике (10), К 2 мл 0,2 М Иа-фосфатного буфера рН 7,5, содержащащего 20 мг БСА и 20 мг производногоАрА, по каплям добавляют 1 мл 0,27. -ного раствора глутарового альдегидав воде, Добавление диальдегида проводят в ледяной бане, а затем реакционную смесь ннкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч. Непрореагировавший глутаровый альдегидсвязывают добавлением избытка лизина. Конъюгат очищают от низкомолекулярных примесей диализом. СодержаниеБАрА в составе конъюгата определяют спектрофотометрически. Эпитопноечисло конъюгата равняется 25-27 молекулам диаденозинтетрафосфата намолекулу БСА,П р и м е р 2, Получение антисывороткн н ее характеристика,Для иьиунизации используют кроликов весом 1,5-2,0 кг. Антиген - коньюгат БСА с 5 , 5 -диаденозинтетрафосфатом (БСА-Н-Ар А) в количестве 1 мграстворяют в 0,5 мл физиологическогораствора и перед; иммунизацией смешивают с 0,5 мл адъюванта Фрейнда до3 14395 образования однородной эмульсии. Полученный препарат вводят подкожно в несколько точек спины кролика, Первую инъекцию проводят с применением5 полного адъюванта Фрейнда. Спустя 2,4 и 8 нед. повторные инъекции проводят с использованием неполного адъюванта фрейнда. Иммунизация животными переносится хорошо. Через 9-10 дн. после четвертой инъекции забирают кровь тотально и получают антисыворотку известным путем.Титр антисыворотки, выраженный в виде концентрации центров связывания 15антигена Я, и,аффинитет антител к антигену в вице константы ассоциации К определяют в эксперименте по связыванию 1-Р 1 АТФ антителами32из разбавленной антисыворотки путем 2 р представления полученных данных в координатах Скэтчарда.Реакцию проводят в буферном растворе, содержащем 50 мИ трис-НС 1, 4 мМ ЗДТА (рН 8,2) К одному и тому же количеству анти сыворотки (конечное разбавление 1;120) добавляют различные количества уР 1 АТФ известной молярной радиоактивности и доводят с помощью буферного раствора объем во всех пробах до Зро 100 мкл. Смесь инкубируют при 4 С в течение часа, Разделение связавшегося в комплекс с антителами и свободного у- Р 1 АТФ осуществляют с помощью суспензии активированного угля, покрытого декстраном. После центрифуги рования (2 мин, 6000 д) определяют , радиоактивность супернатанта и рас, считывают количество АТФ,включившегося в комплекс антиген-антитело. 4 рП р и м е р 3. Определение количества АТФ.Все реагенты готовят на буферномрастворе, содержащем 50 мМ трис-НС 1 и 4 мИ ЭДТА (рН 8,2) у - Р 1 АТФ вы - сокой молярной радиоактивности (6000 Ки/ммоль) добавляют в пробы, содержащие известные возрастающие количества нерадиоактивного АТФ (5,10, 15, 20 и 25 10 ь моль) . В парал р лелькой серии пробы содержат неизвестные количества АТФ. Одна из проб не содержит намеченный АТФ (проба сравнения), Объем всех проб доводят буферным раствором до 150 мкл с учетом анти Б сыворотки (разбавление 1:120), которую добавляют во все пробы в последнюю очередь. Пробы перемешивают встряо хиванием и инкубируют при 40 С в те 08ачение 2 ч. Далее во все пробы, кроме пробы сравнения, добавляют по 50 мкл суспензии активкрованного угля, покрытого декстраном, перемешивают и центрифугируют при 6000 я в течение 10 мин. По 75 мкл супернатанта из каждой пробирки растворяют в 1 мл воды и считают на жидкостно-сцинтилляционном счетчике Из 21 с.Предлагаемый способ определения АТФ прост в исполнении, Для выполнения серии анализов требуется всего несколько мкКи фосфора(33), Поэтому способ может быть осуществлен в любой биохимической лаборатории. Благодаря высокой чувствительности способа чеобходимое для анализа количество фосфоранастолько мало, что в совокупности с коротким периодом полураспада делает работу безопасной для здоровья персонала и исключает радиоактивное загрязнение лаборатории, В настоящее время налаженс 2 регулярный промышленный выпускР АТФ высокой молярной активности, и, следовательно, эта метка широко дос "тупна.Способ найдет применение прежде всего для техкологического контроля качества продукции - для определения молярной радпоа.тнвности нуклеозидтрифосфатов высокой удельной актив- кости, Ранее для определения этой характеристики продукции изотопного синтеза требовалось не менее нескольких мКи 1 Р ) НТФ. Регулярное прове 2дение таких анализов дорого и требует принятия специальных мер для защиты персонала от гблучения.В области биохимического анализа предлагаемый способ делает возможным измерение содержания этого биологически важного нуклеотида в масштабе отдельной клетки и его вкутриклеточного распределения.По предлагаемому способу чувствительность анализа определяется как - 10 - -10 ц моль/пробу, а3/ по известкому 3 1 ОмольпробуСпецифичность, определяемая ло величине 50 ингибирования антител с .АТФ, по предлагаемому способу определяется 1,б , а по известному - 0,37.Формула изобретения Способ определения аденозинтрифосфата, включающий иммунизацию жиКорректор М. Демчик Редактор В. Данко Заказ 6071/44 Тираж 847 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035,.Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Подписное Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород ул, Проектная, 4 вотного гаптеном, ковалентно связанным с бычьим сывороточным албумином,забор крови, выделение антисыворотки, инкубирование ее с анализируемой пробой в присутствии меченогоаналога аденозинтрифосфата, разделение связанного и свободного аденозинтрифосфата и определение количества аденозинтрифосфата по радиоактивной метке, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышенияточности способа эа счет повышения 1439508 ьчувствительности и специфичности радиоиммунного анализа, в качестве гаптена для иммунизации используют58-(6-аминогексил)-5 5 -диаденоэинУтетрафосфата, в качестве меченого аналога аденозинтрифосфата используют 1( у) - 32( 33) Раденозиитрифосфата и разделение связанного и свободного аденозинтрифосфата осуществляют путем адсорбции на активированном угле, покрытом декстраном.