Способ удаления нуклеиновых кислот из ферментсодержащих клеточных экстрактов

СОЮЗ О:ЕЕТСНИХ 80 АНИЕ ИЭОБРЕТЕНИ ОЬ УДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ ВТОРСКОМУСВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институтбиологически активных веществ(56) Соц 1 дап М., Ьосав Ь. 7.,КочпЬег 8 А. Епвушайьс ЗупйЬев 1.в оЕРеохугЬопцс 1 ес АсЫ, - З.В 1 о 1,СЬеа, 1968, ч.243, р.627-638. 4 С 1 2 Н 9 / 00 , С 07 С 7 /О 2 / / / / С 07 С 7 /028 ( С 1 2 Я 9 /00 ,(54) (57) СПОСОБ УДАЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХКИСЛОТ ИЗ ФЕРМЕНТСОДЕРЖАЩИХ КЛЕТОЧНЫХ ЭКСТРАКТОВ ЕЯСНЕК 1 СНЬА С 1,включающий воэдействие на них фракционирующнм реагентом, концентрирование недосадочной жидкости сульфатомаммония и обессоливание полученногоферментационного раствора диалиэом,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью увеличения содержания 4 ермента в целевом продукте, в качествефракционнрующего реагента нспольэуютраствор триэтнлентетрамингндрохлорида рН 7,0-7,5 в количестве, необходимом для доведения концентрациипоследнего в смеси с клеточным ферментсодераащим экстрактом 0,5-1,0 Х.раза буфером, мМ: таис -НС 1 50 (рН 7,0-7,2); 2-меркаптоэтанол 10 (буфер Б). К смеси добавляют фракционирующий реагент - 10 -ный раствор триэтилентетрамингидрохлорида рН 7,0 до конечной концентрации последнего 0,5Суспензию перемешивают 30 мин и осадок удаляют центрифугированием. К надосадочной жидкости добавляют сульфат аммония (55-60 от насыщения). Образовавшийся осадок собирают центрифугированием и растворяют в буфере, мМ;теис -НС 3 10 (рН 7,5); ЭДТА 0,2; 2-меркаптоэтанол 1 О (буфер В) . Для обессоливания проводят диализ против этого же буфера.Все процедуры проводят при 0-5 С.Результаты фракционирования клеточного экстракта при выделении РНК-лигаэы Фага Т 4 приведены в табл, 1,П р и и е р 2. 25 г биомассы Е, со 11. В, инфицированной фагом Т 4 аш 11 82, суспендируют в 75 мл буфера А, Суспенэию обрабатывают и центрифугируют аналогично примеру 1. К разбавленной надосадочной,жидкости добавляют 10 -ный раствор триэтилентетрамингидрохлорида (рН 7,5) до конечной концентрации последнего 1Суспенэию перемешивают 30 мин и обрабатывают аналогично примеру 1. Результаты анализов при выделении ДНК-нолимераэы фага Т 4 представлены в табл 2,П р и м е р 3. Все процедуры проводят аналогично примеру 2, используя 50 г биомассы.Результаты анализов при выделении полинуклеотидкинаэы фага Т 4 приведены в табл. 3. П р и и е р 4. Все процедуры проводят аналогично примеру 1, используя 10 г биомассы, добавляя триэтилентетрамингидрохлорид до конечной концентрации 0,4 .Результаты анализов при выделении РНК-лигазы фага Т 4 представлены в табл, 4.Предлагаемый способ позволяет расширить ассортимент фракционирующих реагентов для удаления нуклеиновых кислот и повысить выход ферментов с 60 до 80-1003. 1 1232680Изобретение относится к биохимии,а именно к способам получения ферментов из микробиологического сырья,Источником ферментов часто служатклетки микроорганизмов. Очистка фермента включает в себя несколько стадий: получение клеточного экстракта,грубое фракционирование клеточногоэкстракта с целью удаления нуклеиновых кислот и очистка фермента хроматографией.В связи с этим важнейшей задачейна первых стадиях очистки ферментовявляется освобождение от нуклеиновыхкислот с помощью различных фракционирующих реагентов,Цель изобретения - увеличение содержания фермента в целевом. продукте.В предлагаемом способе используютв качестве фракционирующего реагента 20раствор триэтилентетрамингидрохлорида в экспериментально подобранномоптимальном режиме. Интервалы рН 7,07,5 обусловлены наиболее высокой стабильностью ферментов при данных эначениях рН, Кроме того, используемыйбуферный раствор на основе теис -НСи триэтилентетрамин в указанной области имеет максимальную буфернуюемкость, При добавлении триэтилентетрамингидрохлорида до концентрацииниже 0,5 . снижаются выходы Ферментов, так как часть их осаждается снуклеиновыми кислотами, Увеличениеконцентрации триэтилентетрамингидрохлорида до концентрации выше 1 вызывает увеличение расхода реакгивабез увеличения выхода Ферментов.Кроме того, избыток реактива затрудняет определение активности ферментов, концентрации белка, а такжевозникают трудности при дальнейшейочистке ферментов вследствие сорбции катиона триэтилентетрамина нахроматографических колонках. 45П р и м е р 1, 100 г биомассыклеток Е. со 11 В, инфицированнойфагом Т 4 аш Ф 82, суспендируют в300 мл буферного раствора, мМ:трис -НС 1 50 (рН 8,0); ЗДТА 2; 2-меркаптоэтанол 1 О (буфер А). Суспенэиюперемешивают 30 мин и обрабатываютна ультразвуковом дезинтеграторе.Клеточные обломки осаждают на центрифуге.55Полученную надосадочную жидкость1232680 ТаблицаАктивность Содержание Процедура Белок,мг нукле- иновых кислот Х 8950 530 0 81 93 49 442 117 2 Табл Бело Активность Содер канне роцед фер- мент бщая,н е.а,2 50 Активность выше 1007 относ ельно клеточного экстракта экстракте нуклеаз, заника- К-полимераэы при ее опреде еточноность ДН Получение клеточного экстра Фракционированиетриэтилентетрамингидрохлоридом сазкдение сульфаом аммония ибессопиваиие точного экстракта Фракционирован триэтилентетра мингидрохлорид Осаждение сультом аммония иобессоливание объясняется наличием вющих действительную актленин. общая,е.а.х,ф 10 удельная,е.а./м удель"ная,е.а/мг Выход фермента,Х иновых кислотХПолучение клеточного экстракта 3113 43,2 13,9 100 20 Фракционированиетриэтилентетра,мингидрохлоридом 1450 47,0 32,4 107 6,5 1450 40,4 27,9 94 0,25 Таблица 4 Активность Содер"жание ок оцедур укле- новых льаяу,а/мг исло Получение клеточного экстракта 4 60,0 26,0 0 2 5,6 6,0 0,6 5,0 Составитель Т. ЗолотареваТехред И.Попович Корректор А. Тяско Редакт унь 37/27 ВНИИПИ Государственн по делам иэобретен 13035, Москва, Ж, Тираж 490го комитета СССРй и открытийаушская наб., д, 4 Подписное акаэ роиэводственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектн Осаждение сульфатом аммония иобессоливание Фракционированиетриэтилентетрамингидрохлоридом Осаждтомобе ение суль аммония и оливание общая,е,а.10 бщая,аэ10 удельная,е.амг Выход фермента, Х Выходфермента