Способ получения фосфопротеинфосфатазы

(5)4 С 12 Х 9/00 // А ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ТЕЛЬСТВУ Н АВТОРСК(72 и В ен ание, о ьюкта Жданова (0888) рийфрак фоце е 4 В нтидиоата, % г 0,8 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(56) Комкова А.И., Межеевский Т.А.,Федорова Н.А, Фосфопротеинфосфатазаиз селезенки свиньи. Биохимия, 28,вып.3, 1963, 482-485. что, с ц вого прод его получ 0,4 М на ,рН 5,8,а ют на фо А-сефаро Б ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФОПРОТЕключающий экстракциюорами тканей животногодиализ и фракционироч а ю щ и й с я тем,величения выхода целен сокращения времениэкстракцию проводятцетатным буфером,ционирование осуществлялюлозе и конкакавалин 1 118Изобретение относится к биохимии, в частности к способам извлечения Ферментов (энзимов),и может быть использовано для получения препаративного средства в клинической и экспе-,5 риментальной медицине,а также в фармакологической промьппленности.Целью изобретения является увеличение выхода целевого продукта и сокращение времени его получения. 10Способ осуществляют следующим образом.Выделяют ядра клеток, фосфопротеинфосфатазу экстрагируют солевыми растворами, диализуют и фракционируют 15 на различных носителях. В качестве экстрагирующего агента используют 0,4 М Иа-ацетатный буфер рН 5,8.На чертеже отражена зависимость величины экстракции Фосфопротеинфосфатазы и балластных белков от ионной силы и солевого состава экстрагирующего раствора.На левой оси ординат отложены величины фосфопротеинфосфатазной актив 5 ности (3), на правой - содержание белка (мг/мл); по оси абсцисс - молярность используемых экстрагирующих растворов. Кроме того, представлены данные об экстракции из ядер клеток селезенки Фосфопротеинфосфатазы30 (кривые 1,111) и белка (кривые 11, 1 У) при использовании На-ацетатного буфера разной молярности (кривые,1, 11) или 0,2 М Иа-ацетатного буфера с добавлением хлористого натрия (кривые 111,1 У). Использование 0,4 М Иа-ацетатного буфера рН 5,8 позволяет избирательно экстрагировать узкую фракцию 40 белков, в том,числе и фосфопротеинфосфатазу и одновременно снижает выход балластных белков, извлечение которых значительно возрастает при добавлении хлористого. натрияКро ме того, исключение ЯаС 1 из экстрагирующего раствора позволяет далее проводить работу с экстрактом без дополнительного удаления соли длительным диализом. Для очистки фосфо протеинфосфатаэы используют афинные сорбенты - Фосфоцеллюлоза и конканавалин-А-сефароза 4 В.П р и м е р. Свежеэамороженная селезенка быка (2,5 кг), сохраняемая 55 при -20 С, размораживалась при комнатной температуре. Выделяли ядра клеток. Осадок ядер (600 мл) промы 2078 2вали перед экстракцией 0,2 М Ба-ацетатным буфером рН 5,8,Все процедуры выделения ядер иФосфопротеинфосфатазы проводили при0-4 С. Осадок ядер гомогенизировалив растворе 0,4 М Иа-ацетатного буфера рН 5,8 в размельчителе тканейРТв течение 15 мин при 8000 об/мин;соотношение осадка ядер и раствора1:5. Гомогенат ядер оставляли на12-14 ч в холодильнике и затем центрифугировали в течение 30 мин при2500 С, Для полного извлеченияФермента из ядер экстракцию проводили 3-5 раз. Экстракты объединялии разводили дистиллированной водой до конечной концентрации Ба-ацетатного буфера рН 5,8 - 0,3 М. К разведенному экстракту добавляли Фосфоцеллюлозу (200 мл) в Н - форме.Смесь тщательно перемешивали и оставляли на 30 мин. После отстаиваниянасадочная жидкость сливалась, Фосфоцеллюлозу промывали 3 раза 5 л 0,3 МИа-ацетатного буфера рН 5,8 и поме-1щали в хроматографическую колочку(4 х 17 см). Колонку промывали 0,3 МХа-ацетатным буфером рН 5,8 (2 л)до полного удаления несвязавшегосябелка, фосфопротеинфосфатазу элюировали 1 М На-ацетатным буфером рН 5,8.Элюат (500 мл) диализовали против дистиллированной воды до конечной концентрации Иа-ацетатного буфера рН 5,80,2 М.,Диализат центрифугировалив течение 30 мин при 2500 С,осадокотбрасывали. Затем проводили повторную хроматографию фосфопротеинфосфатазы на Фосфоцеллюлозной колонке(1,6 х 25 см)Условия сорбции, промывки и элюции фермента аналогичны первой хроматографии на.фосфоцеллюлозе.Элюат (40 мл) после пов орной хроматографии на фосфоцеллюлозе Фракционировали на сефадексе С -75 (размер колонки 3,5 х 80 см), уравновешенном 0,3 М Ма-ацетатным буфером рН 5,8,Фосфопротеинфосфатазу выделяли собъемом элюции 365 мл, фермент послегель-хроматографии подвергали дальнейшей очистке методом аффиннойхроматографии на конканавалин-А-сефарозе 4 В (размер колонки 1,5 х 4 см),уравновешенной 0,3 М На-ацетатным буфером рН 5,8. Колонку промывалиэтим же буфером (300 мл), фосфопротеинфосфатазу элюировали раствором0,5 М маннозида в 0,3 М Иа-ацетатномбуфере рН 5,8 (15 мл конечного продук182078 4ампулах при -20 ОС. Постадийная характеристика способа сведена н табл. 1.Таблица 1 гУдельная Степеньактив очистки Выход, 7 Этапы очистОбщая активКоличествобелка мгР ки ностьед./мг ностьед. 100 0,8 11250 11000,0 345,0Экстракт 23 18,0 6225 фосфоцеллюлоза 1 29 74 59,0 3150 53,0 фосфоцеллюлоза 214 21 2400 171,0 14,0 СефадексС -75 Конканавалин-А-сефароза 4 В 14 1596 1330, 0 1663 1,2 Выход Фермента после конечного этапа очистки составлял 143. Электрофорез проводят в трубках 0,6 х 10,5 см 35 в течение 3 ч при силе тока 5 мА на трубку, Местоположение Фосфопротеинфосфатазы выявляют по образованию окрашенного комплекса е-нафтола с прочным синим Б. Для этого гели 40 инкубируют в О, 1 М цитратном буфере рН 5,8, содержащем 0,15 мг/мл прочного синего Б и 0,5 мг/мл ь - нафИсточник фермента Характеристика Ядра селезенки бы- Ядра печвни быкака (предлагаемый (12)способ) Количество этапов очистки 1,7 14 Выход конечного продукта (0) 3 1та). Препарат сохраняет активностьболее 2 лет при хранении в запаянных Из табл, 1 видно, что из 2,5 кг селезенки быка удается выделить 1,2 мг очищенного продукта, Выделенный препарат фосфопротеинфосфатазы очищен в 1663 раза и обладает удельной активностью 1330 ед. тилфосфата в течение 30 мин при37 С, Белки в гелях окрашивают раствором, содержащим О, 17 Кумасси бриллиантового голубого С - 250,П уксусной кислоты и 253 изопропанола, в течение 1-4 ч.Гомогенностьконечного продукта выявляют методомдвойной иммунодиффузии,Мол, масса Фосфопротеинфосфатазыопределенная методом диск-электро-,,Фореза в нативных условиях и .методомгель-хроматографии на сефадексе,С -75, составляет 33500 дальтон.Для наглядности эффективностипредлагаемого метода по сравнениюс известным (12) в табл. 2 представлены некоторые характеристики конечного продукта.Т а блица 21182078 Продолжение табл.2 Источник фермента Характеристика Ядра печени быка Ядра селезенки быка (предлагаемыйспособ) 112) 1663 Степень очистки 845 Гомогенность Индивидуальный белок Индивидуальный белок 0,090(субстрат фосфофорилааа а) Ингибиторы Х - Эт илмале и нимиди-Хлормеркурибензоатфторид йатрия Активаторы Аскорбиновая кислота2-МеркантоэтанолДитиотреитол Составитель М.ПознякРедактор Н.Швьщкая Техред Ж.Кастелевич Корректор М.Самборская Заказ 6069/26 Тираж 524 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д, 4/5филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Технико-экономическая эффективность способа получения фосфопротеин 40 фосфатазы по сравнению с известным заключается в значительном увеличении выхода конечного продукта (3-4 раза), упрощение процесса за счет сокращения числа этапов с 11 до 4 (из процесса исключены фракционирование45 осаждением сернокислым аммонием, этиловым спиртом н ряд стадий ионообменной хроматографии, многочасовые диализы перед этапами ионообменной хроматографии) и сокращения времени процедуры вьщеления, что особенно важно длявьщеления нативныхбиологически активныхпрепаратов ферментов .