Способ выращивания уксусно-кислых бактерий

. Востр Л.Ф.П орденаого и 1 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРГЮ ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ РСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Казанский государственный Ленина и ордена Трудового Краси Знамени университет им.В.И.Ульянова- Ленина(56) Беляева М.И Куприянова Ф.Г., Буриненко Б.М. Влияние панкреатической дезоксирибонуклеазы на размножение ЕзсЬег 1 сМа со 1, Микробиология.1976, 45, вып.5. с.917-919.Технологический регламент производства аскорбиновой кислоты ВПО "Союзвитамины", Йошкар-Ола. Утвержден в управлении "Союзвитамины" Министерства медицинскс промышленности(54)(57) СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ УКСУСНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ СЬБСОЮВАСТЕК ОХУВАЮЯ, предусматривающий приготовлениинокулята клеток бактерий с последующим внесением его в питательную среду, содержащую сорбит в качестве источника углерода и дрожжевой автолизатв качестве стимулятора роста, о т -л и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью повышения скорости размножениябактерий и степени окисления сорбита в сорбозу, внесение инокулята впитательную среду осуществляют совместно с панкреатической дезоксирибонуклеазой, взятой в концентраци110 - 2 .10" мг/мл.1162876где 0,396 1Изобретение относится к промышленной микробиологии, в частности кспособам выращивания уксуснокислыхбактерий, преимущественно используемых в производстве аскорбиновойкислоты,Цель изобретения - повышение скорости размножения бактерий и степениокисления сорбита в сорбозу,П р и м е р 1, Выращивание С 1 псопоЬасСег охуйапз в лабораторных условиях в питательной среде, содержащей панкреатическую ДНКазу. При изучении влияния панкреатической ДНКазына скорость размножения уксуснокислых цбактерий и на жизнедеятельность микроорганизмов, приявляющуюся в способности их окислить сорбент в сорбозу.С 1 псопоЬасгег охуйапз культивируютв питательной среде следующего состава мл: сорбит 400 (23-28 Е-ныйраствор ), дрожжевой"автолизат 60(67. сухих веществ ), вода 540. Содержание сухих веществ в питательнойсреде должно быть не менее 10-127, 25рН 5,0-5,6.Для подготовки посевного материала двухсуточную культуру с поверхности агаризованной среды указанногосостава переносят в пробирки с жид- Зокой средой того же состава, инкубируют в термостате при 32 С в течение48 ч, после чего суспенэию разбавляют в 10 раэ свежей средой и разливают по 50 мл в колбы емкостью500 мл. Одновременно в колбы вносятпанкреатическую дезоксирибонуклиазу (ДНКазу )и культуру выращивают при32 С 48 ч. Через 3,12,24,36,48 чпосле посева отбирают прббы для регистрации скорости размножения клеток,определяемой по приросту биомассы наспектрофотометре, при длине волны640 нм. В этих же пробах контролируют глубину окисления сорбина в сорбо.зу. С этой целью отбирают 50 мл испытуемого раствора в мерную колбуемкостью 100 мл, куда добавляют 1 мл50 Е-ного раствора азотнокислого свинца и 1 мл 5 Е-ного раствора ИаОН.Содержимое колбы доводят до метки водой, энергично встряхивают и фильтруют, Затем с помощью поляриметра определяют угол вращения в прозрачномиспытуемом растворе, Содержание сорбоэы в исследуемой пробе (г/л )определяют по формулеХ = 0,396 (К-Р ) 2,2- коэффициент соответствия между 1 шкалы поляриметра и содержанием сорбозы в г/100 мл;Р - показания поляриметра; К - величина угла вращениякварцевой трубки;2 - коэффициент пересчетана нормальную навеску.Глубину окисления сорбита в сорбозу 7. вычисляют по формулеС 100ХВ где С - содержание сорбозы вг/00 мл окисленного раствора.В - содержание сухих веществв г/100 мл окисленного раствора, определенных по рефлектометруВ качестве контроля используют теже условия выращивания уксуснокислыхбактерий, но ДНКазу добавляют в питательную среду, инактивированную путемнагревания при 100 С 10 мин,Для подбора дозы ДНКазы, стимулирующей ра"множение бактерий, используют несколько концентраций фермента 1О мл/г, 1 "10 мг/мл, 1.10 мг/мл,При соблюдении всех описанных условий проведения опыта не обнаружено стимулирующего влияния ДНКазы вконцентрации 1 О мг/мл на размножение уксуснокислых бактерий и глубину окисления сорбита в сорбозу.Не обнаружено также стимулирующего действия ДНКазы в концентрации1 О мл/мл на размножение уксуснокислых бактерий и глубину окисления сорбита в сорбоэу.Панкреатическая ДНКаза в концентрации10 мг/мл способствует уско -рению размножения уксуснокислых бактерий. Данные о влиянии панкреатической ДНКазы на размножение уксус.нокислых бактерий и глубину окисления сорбита в сорбоэу при выращивании С 1.охуйапэ в лабораторных условиях представлены в табл. и выражены в процентах стимуляции по от-.ношению к контролю, принятому за007Как видно из табл,1, уже через 3 ч.культивирования в среде с ферментом происходит ускорение размножения клеток на 28,97. Однако в этотпериод увеличение глубины окислениясорбита в опыте по сравнению с876 Таблица 1 Время инкубации клеток с ДНКазой, ч Стимуляция раз- Стимуляциямножения клеток, окисления сор7 бита, Ж 28,9 3 ч 0 29,0 12 ч 25,0 24 ч 17,6 20,0 18,2 36 ч 10,3 48 ч 12,8 10,5 3 1162 кон:ролем не наблюдается. Наиболее высокого значения величина стимуля-ции размножения клеток и окисления сорбита в сорбоэу 29 и 257 сЬответственно), достигает через 12 ч роста культуры в присутствии панкреа. тической ДНКазы. На протяжении последующих 12 ч роста культуры стимулирующий эффект сохраняется, а к концу периода исследования уменьша О ется в два раза.Таким образом, панкреатическая ДНКаза, добавленная в питательную среду в конечной концентрации 110 мг/мл стимулирует размножение 15 клеток в лабораторных условиях культивирования С 1 цсопоЬасег охудапз. Стимулирующее действие ДНКаэы сопряжено с усилием процесса окисления сорбита в сорбозу. щП р и м е р 2. Выращивание уксуснокислых бактерий в производственных условиях в прединокуляторе при добавлении в питательную среду панкреатической ДНКазы в конечной-ьконцентрации.10 - 2 1 О мг/мл (1 10 - 2. 10 фмг/л среды ).С целью накопления биомассы в производственных условиях уксусно- кислые бактерии выращивают поэтапно, начиная с меньшей емкости - прединокулятора (100 м ), и завершая процесс ферментации в емкостях 10000- 13000 л.В прединокуляторе культуру выращивают в течение 12 часов, Ос новным тестом, определяющим жизнедеятельность бактерий и позволяющим перейти к следующему этапу выращивания клеток в больших емкостях, является глубина окисления сорбита в сорбозу этими бактериями, котораячерез 12 ч должна быть не менее25-307. При выращивании культуры в пре - динокуляторе емкость заливают 60 л питательной среды, засевают 48-часовой клеточной суспензией, выращенной в лабораторных условиях, иэ расчета 103 на объем среды. Одновременно с инокулятом вводят панкреатическую ДНКазу. Через каждые 3 ч роста культуры из прединокуляторов отбирают пробы для определения влияния панкреатической ДНКаэы на глубину окисления сорбита в сорбоэу. Результаты исследований представлены в табл.2. Иэ табл.2 видно, что выращивание клеток в прединокуляторе в присутствии ДНКазы в течение 9 ч приводит к стимуляции .окисления сорбита в сорбозу на 40-607. Через 12 ч роста культуры стимулирующий эффект уменьшается, однако сохраняется на уровне 14-287, Полученные результаты позволяют заключить, что ДНКаза; добавленная в среду культивирования, положительно влияет на жизнеспособность уксуснокислых бактерий. Глубина окисления сорбита в сорбозу через 9 ч выращивания бактерий в среде с ДНКаэой достигает 25-303, что позволяет перевести культуру из прединокулятопа в следующую емкость (инокулятор ) и, следовательно, сократить продолжительность выращивания клеток в прединокуляторе на 3 ч.1162876 Таблица 2 ПрединокуляторГлубина окисления сорбита в совбозу через 12 ч роста клеток 9 ч роста клеток Опыт Контроль Стимуляция,% Опыт Контроль Стимуляция,% 29,5 17,5 67,0 30,5 21,5 42,0 58,0 49,8 53,2 41,3 51,7 44,8 56,9 49,7 16,0 28,0 23,6 24 9 16 1 54 0 28,2 23,2 69,0 14,5. Составитель 3. ГолимбетТехред Л.Коцюбняк Корректор С.Черни Редактор О.Бугир Заказ 4065/25 Тираж 525 Подписноед ВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий13035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5 филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная,4 П р и м е ч а н и е:Процент стимуляции выражен по отношениюк контролю, принятому,за 1 С 0%.Контроль - глубина окисления в соответствующих прединокуляторах без ДНКазы.