Способ получения протеолитического фермента

(54)(57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО .ФЕРМЕНТА) заключающийсяв выращивании продуцента Восатйъазр. 1 на среде мясопептонного бульонс 37-ным содержанием глюкозы с последующим перенесением на синтетическую среду СР, инкубацией и высаливанием фермента сернокислым анием из культуральной жидкости, ол и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью упрощения процесса и увеличения выхода целевого продукта, посчто щего поцесс г4 Х-ный з трия,ид ипирта перекрис ОХ-ный р о тлич аюкачестве ини то ммот вани Сги используют-метиленбисультрафиолет н ДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИ(56) 1. Егороз Н.С Уманова ВО фиоринолитической и протеолической активности некоторых мибактерий и актиномицетов. - "Пбиохимия и микробиология", 1965, 595,2. Авторское свидетельствоВ 493504, кл. С 12 В 13/ 10, 19 ле инкубации суспензию клеток продуцента смешивают с реагентом, выэы" вающим процесс гелеобразования, до достижения содержания биомассы в реагенте О, 1-3,0 Х, затем в полученную смесь вводят инициатор гелеобразования, смесь инкубируют в течение 2- 30 мин при 12-20 С, затем гель или его пленку фрагментируют на гранулы размером 0,5-1,5 мм и инкубируют на синтетической среде СРв течеоние 20-24 ч при 28-30 С, после чего отделяют культуральную жидкость от гранул и осаждают из нее целевой йродукт. 2. Способ пощ и й с я тем,агента, вызываюразовання, исполвор альгината назованныйеакриламполивинилового с3. Способ пощ и й с я тем,1 1157Изобретение относится к получениюферментных препаратов и может бытьприменено в микробиологической промышленности, медицине, гематологии,физиологии и биохимии микроорганизмов.Известей способ получения протеазиммобилизованными в ПААГ клеткамиЯйгерйошусез ГгаМае, заключающийсяв том, что суспензию клеток в фиэиологическом растворе включают в 5%ный полиакриламидный гель с содер 1жанием 10% сшивки (И,М -метиленбисакриламида) в течение 10 мин при5 С и атмосфере газообразного азота. 15Гель с включенными в него клеткамиразрезают на небольшие блоки (2-3 мм)и обрабатывают реакционной средой(0,5% крахмала, 0,5% мясного экстракта, 0,05% дрожжевого экстракта,0,02% СаСР, 0,01% МяВО 7 НО) трираза по 2 ч; Для повышения выходафермента гранулы с клетками обрабатывают 75%-ным этанолом и используютдо 30 раз 11.Однако этот способ неэкономиченвследствие получения Фермента иммобилизованными клетками на дорогостоящей реакционной среде, содержащей0,5% крахмала, 0,5% мясного экстракта и 0,05% дрожжевого экстракта,трудоемок вследствие проведения до-.полнительной обработки гранул реакционной средой и этанолом, достаточно длителен и у целевого продук- З 5та отсутствует Фибринолитическая активностьНаиболее близким к изобретениюпо технической сущности и достигаемому результату является способ получения протеолитического ФерментаФибринолитического действия, которыйпредусматривает использование проактиномицетов (в частности, Иосагс 1 азр,1) в качестве продуцентов фибринолитических (фибрин - основнаясоставная часть тромба) ферментов,Продуцент выращивают на посевнойсреде (МПБ+3% глюкозы) в течение3 сут, а затем на ферментационной 50среде (синтетическая среда СР)также 3 сут отделяют клетки, а изкультуральной жидкости с помощью. сернокислого аммония высаливают фермент с последующим диализом и лио- . 55. Фильным высушиванием 12,Однако известный способ обладаетнедостаточно высоким выходом целевого продукта и невысокой скоростью егополучения, Кроме того, способ неэкономичен вследствие необходимостимногократного выращивания посевногоматериала и длительности процесса итрудоемок,11 ель изобретения - упрощение процесса и увеличение выхода целевогопродукта.Поставленная цель достигаетсятем, что согласно способу полученияпротеолитического фермента, заключающемуся в выращивании продуцентаИосагйта зр.1 на среде мясо-пептонного бульона с 3%-.ным содержаниемглюкозы с последующим перенесениемна синтетическую среду СР, инкубацией и высаливанием фермента сернокислым аммонием из культуральнойжидкости, после инкубации суспензиюклеток продуцента смешивают с реагентом вызывающим процесс гелеобразования, до достижения содержаниябиомассы в реагенте О, 1-3,0%, затемв полученную смесь вводят. инициаторгелеобразования, смесь инкубируютв течение 2-30 мин при 12-20 С, затем гель или его пленку фрагментируют на гранулы размером 0,5-1,5 мми инкубируют на синтетической среде СРв течение 20-24 ч при 28 о30 С, после чего отделяют культуральную жидкость от гранул и осаждают из нее целевой продукт,В качестве реагента, вызывающегопроцесс гелеобразования, используют4%-ний раствор альгината натрия, перекристаллизованный акриламид и10%-ный раствор поливинилового спирта.В качестве инициатора гелеобразования используют О, 1 М раствор/СаСГМ,И -метиленбисакриламидаи облучение ультрафиолетовыми лучами.Предлагаемый способ осуществляется следующим образом,В среду МПБ с 3%-ным содержаниемглюкозы вносят смыв клеток Иосагйха зр,1 с агариэованной среды этого же состава икультивируют 48 ч,после чего проводят процесс гелеобразования с участием инициатора гелеобразования, смесь инкубируют в течение 2-30 мин при 12-20 С, затемгель или его пленку фрагментируют награнулы размером 0,5-1,5 мм и инкубируют на синтетической среде СР11573в течение 20-24 ч при 28-30 С,после чего отделяют культуральнуюжидкость от гранул и осаждают изнее целевой продукт.Предлагаемый способ является более упрощенным, так как не содержитопераций обработки альгината натриякарбонатом магния, обработки включенных в ПААГ клеток реакционной средой и этанолом, насыщения полимери" 1 Озуемой смеси газообразным азотом,П р и м е р 1. В среду МПД+37глюкозы вносят смыв клеток Мосагй 1 азр. 1 с агаризованной среды этого жесостава, культивируют 48 ч при 28- 1530 С в колбах .на 750 мл со 100 мпсреды на круговых качалках(220 об/мин), после чего клетки скультуральной жидкостью (1 О мл) смешивают с 47-ным раствором альгинатанатрия (10 мл) на дистиллированнойводе. Смесь вносят по каплям (диаметр отверстия 1 мм) с помощью пипетки в О, 1 М раствор СаСЕ при комнатной температуре, Образовавшиеся 2шарики геля диаметром 1,5 мм оставляют в растворе хлорида кальция при4 С на 1-2 ч для стабилизации.20 мл гранул с клетками помещают в колбу на 250 мл, содержащую 50 мл среды СРс 0,05 М СаСЮ, и инкубируют при 28-30 С на круговой качалке (220 об/мин). Через 20 ч культуральную жидкость сливают с гранул, промывают их физиологическим раство- З 5 ром и запивают 50 мл свежей среды СРс 0,05 М СаСИ . Иэ полученной . культуральной жидкости Фермент.осаждают сернокислым аммонием при насыщении 0,6-0,8. Биосинтез фермента на 40 синтетической среде СРс помощью иммобилизованных в Са-альгинатный гель клеток продуцента повторяют многократно. Получают суммарный выход целевого продукта 13 100 усл.ед./мл. 4 зП р и м е р 2. Клетки продуцента, выращенные на МПБ+37 глюкозы, как в примере 1, отделяют от культу- ральной жидкости центрифугированием при 6000 об/мин в течение 10 мин, Клеточную суспенэию в физиологическом растворе включают в 1 ОПААГ с 57. - ным содержанием сшивающего агента- И,И-мечнленбисакрнламида (МБА). Для этого к 11 мл водного раствора, содержащего 1,9 г перекристаллизованного акрнламида (АА) и 0,1 г МБА, добавляют 6 мл клеточной суспензии,0574содержащей 600 мг биомассы, 3 мл7-ного водного раствора персульфатааммония и 0,4 мл Ю,К,Я ,Ю -теграметил(этилендиамина (ТЕМЭД) . Полимериэациюведут при 12-14 С в течение 2-4 мин,Полученный блок геля механическиФра ментируют продавливанием черезсито. Гранулы размером 0,5 мм многократно промывают декантацией физиологическим раствором для удаленияневключающихся в гель клеток и остатФков компонентов полимеризационнойсмеси,20 мл гранул с клетками используют для биосинтеза фермента на среде СР, как описано в примере 1.Суммарный выход целевого продуктасоставляет 28764 усл.ед./мл.П р и м е р 3. 107-ный раствор поливинилового . спирта в дистиллированной воде нагревают на водяной бане до полного растворения. 10 мл охлажденного ПВС перемешивают с суспензией клеток, содержащей 50- 200 мг биомассы, полученной, как в примере 1, и отделенной от культу- ральной жидкости центрифугированием, как в примере 2. Осмесь выливают в чашку Петри (диаметр 10,5 см, слой 0,5 мм) и облучают 5-15 мин ультрафиолетовьии лучами (кварцевая лампа ПРК) при комнатной температуре. Полученную пленку высушивают 1,5-3,0 сут, фрагментируют на кусочки размером около 1 мм. Перед фрагментацией вожможно также выдерживание пленки с клетками 9 сут при 4 С для повышения ферментативной активности иммобилизованных в ПВС клетокродуцента.Измельчейную пленку геля с клетками помещают в колбу на 250 мл с 50 мл среды СРи инкубирают 24 ч при 28-30 С на качалке (220 об/мин). Затем культуральную жидкость отделяют декантацией, выделяют из нее Фермент, как в примере 1. Гель с клетками промывают физиологическим раствором и заливают свежей средой СР. Эти процедуры многократно повторяют. Получают суммарный выход целевого продукта 30030 усп.ед,/мл.Сравнительные данные результатов опытов по известному и предлагаемому способам представлены в таблице.Из данных, приведенных в таблице, видно, что суммарный выход ФерВариант опыта интеэ сл.ед,/мл 2081 0 28,0 Свободные Косатка в тки М 3 а зр.1ованыгинатный гель Клетки Яо иммобилизв Са-ал 389 83,6 30030 28764 иловый спн ол полиакрил амид Составитель Е,Лаврова Редактор Н.Яцола Техред А.Бабинец Корректор А.Зимокосоказ 3282/2ВНИИПИ Тираж 525Государственногоделам изобретенийосква, Ж, Раушс Подписномитета СССРткрытнйнаб д, 4/5 11303 фил 1 ИППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная. Ф 5 1 мента при использовании иммобилиэованных клеток нокардии возрастает в б,5 раз, а скорость синтеза Фермента - в 3,5-3,9 раза по сравнению с известнья способом (свободные клетки). В предлагаемом способе происходит не. только ускорение и увеличение выхода фермента, но и возрастание экономичности способа в силу того, что культуру продуцента выращивают один раз, а весь осталь,ной процесс проводят на этих же,закрепленных в геле, клетках, меняяежедневно ферментационную средуопределенного состава. Использова"5 ние,нммобилнэованных клеток повьппает экономичность и дает возможностьсократить время, затрачиваемое набиосинтез фермента,. в 2-3 раза и облегчает очистку, так как сразу по 10 лучают раствор фермента, свободныйот клеток продуцента,