Способ выделения гликозаминогликанов из лейкоцитов крови

(19) (11) 4(51) А 61 К 35/14 ГОСУДАРСТЮННЫЙ НОМИТЕТ СССРГО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТ 19ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Ленинградский ордена ТрудовогоКрасного Знамени и ордена Дружбынародов научно-исследовательскийинститут гематологии и переливаниякрови(56) 1. Мигала К, В 1 осЬеш 1 са 1 Мей 1-.спе, 1980, 23, 324-335 (прототип),(54)(57) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ГЛИКОЗА-МИНОГЛИКАНОВ ИЗ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ путем экстракции липидов органическими растворителями, обработки протеолитическими ферментами, осаждения балластных белков с последующей.обработКой продукта четвертичноаммонийными основаниями и этанолом, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью повышения чистоты целевогопродукта, упрощения и ускорения способа, экстракцню липидов проводятацетоном, протеолитическое расщепление - папаином в присутствииЭДТА и цистеина, целевой п;одуктполучают дифференциальной экстракцией растворами солей возрастающейионной силы.Изобретение относитсяк клинической биохимии и касается способа выделения гликозаминогликанов (ГАГ) из лейкоцитов человека.Известен способ выделения ГАГ из лейкоцитов, включающий термоденатурацию лейкоцитов, экстрагинирование липидов этанолом и эфиром, переваривание проназой при 55, обработку щелочью, отделение белков и. ну клеиновых кислот трихлоруксусной кислотой, диализ для освобождения от низкомолекулярных примечей и осаждение конечного продукта цетилпиридинхлоридом с последующим переосаж дением этиловым спиртом, насыщенным ацетатом натрия13.Однако полученные указанным методом ГАГ характеризуются гетерогенностью, что затрудняет исследование 20 их состава в клетках крови и изучение свойств отдельных видов ГАГ. Кроме того, известный метод не экономичен, как в силу длительности всей процедуры (13-14 дней), так и 25 из-за применения дорогого импортного фермента (проназы).Цель изобретения - повышение чис. тоты .препарата гликозаминогликанов, упрощение и ускорение способа его З 0 выделения.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения гликозаминогликанов из лейкоцитов крови путем экстракции линидов орга ническими растворителями, .обработки протеолитическими ферментами, осаждения балластных белков с последующей обработкой продукта четвертичноам- монийными основаниями и этанолом 40 экстракцию липидов проводят ацето-. ном, протеолитическое расщепление - папаином в присутствии ЭДТА и цистеина, целевой продукт получают дифференциальной экстракцией раство рами солей возрастающей ионной силы.Способ осуществляется следующим образом.Лейкоциты крови, выделенные дифференциальным центрифугированием, 50 обрабатывают двукратно 10-15 объема" ми ацетона, .фильтруют на воронке Бюхнера и высушивают на воздухе. Полученный сухой порошок растирают при помощи гомогенизатора с фермент но-буферной смесью, содержащей кристаллический папаин (2 мг на .100 мг сухого порошка), 5 мМ цистена и 4 мМ ЗДТА а в 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,5. Ферментно-буфернаясмесь берется из расчета 10 мл на 100 мг высушенных клеток, Суспензию клеток переносят в небольшие флаконы и инкубируют при 65 С в ультратермостате в течение 4 ч. После окончат ния переваривания к полученному лизату добавляют 507-ную трихлоруксусную кислоту до конечной концентрации 57, и в течение ночи при 4-6 С происходит осаждение белков и нуклеиновых кислот. Осадок удаляют центрифугированием при 3000 об/мин при 0 С, К супернатанту при интенсивном перемешивании добавляют 4 объема охлажденного до 0-(-5) 967-ного этанола и 507-ного раствора ацетата до конечной концентрации 0,5 Х. Оставляют для формирования осадка при 0-4 С в течение 18-24 ч. Сформировавшийся хлопьевидный осадок, представляющий собой ГАГ в смеси с гликогеном и другими .высокомолекулярными соединениями, отделяют. центрифугированием при 3000 об./мин при 0-4 в течение 20 мин. Осадок растворяют в дистиллированной воде, добавляют ЯаС 1 до конечной концентрации не выше 0,15 М, обеспечивая полное растворение, после чего добавляют 0,2 объема 5 Х-ного раствора бромистого цетилтриметиламмония (цетавлона) - "сЬешаро 1" (Чехословакия). Специфическое формирование комплек", са ГАГ с цетавлоном происходит в течение 30-60 мин при 37 С или 8-10 ч при комнатной температуре. Для уплотнения осадка добавляют5-10 мг целита и отделяют комплекс ГАГ - цетавлон центрифугированием. Осадок промывают 0,2 М БаС 1 для удаления низкомолекулярных балластных примесей. Дифференциальнуюэкстракцию ГАГ осуществляют поочередным добавлением к осадку небольших объемов растворов хлористогонатрия в концентрации 0,5, 0,7, 1,0 и 2,0 М. Вследствие гетерогенности ГАГ (различий их по молекулярной массе и полианионным свойствам) их комплексы с детавлоном различаются по растворимости, и при помощи дифференциальной экстракции удается выделить отдельно разные виды ГАГ. Фракции, экстрагируемые 1 М и 2 М КаС 1, не различаются по составу, поэтому их объединяют. Полученные3фракции ГАГ переосаждают и дополни" тельно очищают от примесей добавлением 4 объемов охлажденного до 0 этанола с добавлением ацетата Иа в конечной концентрации 0,5-1%. Осаждение очищенных ГАГ происходит в течение ночи при 0-4 С, осадки отделяют центрифугированием при 3000 об./мин в течение 20 мин. Полученные осадки ГАГ растворяют в дистиллированной воде или физрастворе, при необходимости проводят стерилизующую фильтрацию через мембранные фильтры "Миллипор", хранят в замороженном или лиофилизированном состоянии. Для анализа фракций применяют электрофорез в ацетатцеллюлозе, содержание и выход ГАГ определяют по концентрации уроновых кислот, определенной карбазольным методом. 2 О Выход ГАГ в среднем составляет 110- 130 мкг уроновых кислот на 100 мг ацетонового порошка лейкоцитов.П ри м е р 1. К 280 мл донорской крови, заготовленной на консер". 25 ванте с цитратом натрия, добавляют 70 мл 3%-ного раствора пищевой желатины в физиологическом растворе хлорида натрия, после чего в течение 1 ч клетки крови оседают при 37 С. Верхний плазменный слой, содержащий лейкоциты и тромбоциты, переносят в центрифужные стаканы и центрифугируют при 1200 об/мин в течение 15 мин при комнатной температуре на центрифуге К. Осадок35. лейкоцитов (1 мл) двукратно промы,вают 10 мл физиологического раствора на центрифугер ПЛКтри 1000 об./мин, Для удаления примеси эритроцитов к промытому осадку добавляют 7 мл охлажденного 0,83%-ного . ЯН-СХ в 0,0125 М трис-НСВ буфере, рН 7,4, затем пробу тщательно перемешивают и удаляют образовавшийся гемолизат центрифугированием на цент рифугер ЦЛК. Осадок промывают физиологическим раствором, Выделенные клетки лейкоцитов (в объеме 0,6 мл) обрабатывают 9 мл ацетона, затем растирают в гомогенизаторе и фильтруют через воронку Бюхнера,используя вакуумный насос, Полученный порошок обезвоженных и частично обезжиренных клеток высушивают на воздухе. 55 1140787 Ф Из 280 мл донорской крови получают 100 мг сухого порошка клеток. 4К 100 мл сухого порошка клетокприливают 10 мл ферментно-буфернойсмеси, содержащий 2 мг кристаллического папаина, 8,7 мг цистеина и 18,6 мг 5 ЭДТА в 0,05 М фосфатном буфере,рН 7,5, и растирают в гомогенизаторе.Взвесь переносят во флакон емкостью20 мл и инкубируют в ультратермостате при 65 С в течение 4 ч. ПослеоО окончания переваривания к полученному лнзату добавляют 1,0 мл 50% ТКУ.Смесь оставляют на ночь в холодильнике при 4 С для осаждения белкови нуклеиновых кислот. Осадок удаляют 5 центрифугированием при 3000 об/минпри 0 С. К супернатанту при интенсивном перемешивании добавляют 40 мл96%-ного охлажденного этиловогоспирта и 0,5 мл 50%-ного раствораацетата На. Оставляют до формирования осадка в течение 18 ч при 4 ССформировавшийся хлопьевой белыйосадок отделяют центрифугированиемпри 3000 об/мнн при -2 С в течение20 мин, супернатант отбрасывают, Оса.док растворяют в 2,0 мл дистиллированной воды и добавляют 3 капли1,0 М раствора хлорида натрия дополного растворения. К пробе добавляют 0,4 мл 5%-ного водного, растворацетавпона; Осаждают ГАГ при 37 Св течение 1 ч. Для получения болееплотного осадка добавляют 10 мгцелита и проводят центрифугирование пробы при 4000 об/мин в течение10 мин при комнатной температуре,супернатант удаляют, а осадок суспендируют в 2,0 мл 0,2 М раствораМаСХ. Дифференциальную экстракциюГАГ из комплекса с цетавлоном осуществляют добавление- к осадку раствора хлорида Ба:1-я экстракция проводились 0,5 М НаСХ (1,5 мл); 2-яэкстракция - 1,0 мл 0,7 М КаСЙ,3-я - 1,0 мл 1,0 М МаСК, 4-я 0,5 мл2,0 М раствора хлорида натрия, После каждой экстракции пробу центрифугируют. Экстракты ГАГ, получен"ные при концентрации НаСХ 1,0 и2,0 М, объединяют. Полученные фрак"ции ГАГ при концентрации хлорида На 0,5, 0,7 и 1 + 2,0 М переосаж" дают соответственно. 6,0; 4,0 и.6,0 мл. переохлаждеиного до -4 Сэтаиола при этом в каждую пробу с ГАГ добавляют 3 капли 50%-ного раствора ацетата На. Осадки, содер.жащие очищенные ГАГ, растворяют1140787 ВНЮШИ Заказ 360/5 Тараа 722 Подписное 4 елаал ППП "П 1 веаФ", гфУзцгорюд, ул.Яроежтжая, 4 Эв дистиллированной воде. После определения содержания ГАГ пробы заморакивают или подвергают стерилизующей фильтрации с последующей лиофилизацией целевого продукта. 5Выход ГАГ из лейкоцитов составляет 120 мкг уроновых кислот из 100 мгсухого порошка.П р и м е р 2, Вся процедураполучения ГАГ проводится по примеру 1, за исключением некоторых режимов - параметров способа. Так, например, при получении лейкоцитовосадок лейкоцитов (1,2 мл) двукратнопромывают 15 мл физиологического . 15раствора; для удаления примеси эритроцитов к промытому осадку добавляют10 мл охлажденного 0,833-ного ННСВв 0,0125 М трис-НСЙ буфереВыделенные клетки лейкоцитов (0,7 мл) обрабатывают 7,0 мл ацетона. Из 280 млдонорской крови получают 105 мг сухо.го порошка клеток,При получении ГАГ осаждение белков и нуклеиновых кислот проводят 25при 6 СПосле добавления охлажденного спирта и ацетата натрия осадокформируется в течение 24 ч. Осаждают ГАГ при 37 С в течение 30 мин,Для уплотнения осадка добавляют 305 мг целитаВыход ГАГ из лейкоцитов состаьпяет 115 мкг уроновых кислот иэ 100 мгсухого порошка.П .р и м е р 3. То же самое, чтов примере 1, только стадию осаждения ГАГ цетавлоном проводят при комнатной температуре в течение 10 ч.Выход ГАГ из лейкоцитов составляет 130 мкг уроновых кислот из 100 мгацетонового порошка клеток,Идентификацию гликозаминогликонов осуществляют следующим образом.Анализ фракций ГАГ включает определение содержания гексазаминов,галактозаминов, уроновых кислот,сульфата и электрофоретический ана-лиз на ацетатцеллюлозных пленках.Электрофорез проводят в 0,25 МСа-ацетатном буфере, рН 5,5 при плот- оФ ности тока 0,5 Ма/см в течение 4 ч на приборе ПЭфна ацетатцеллюлозных пленках фирмы РгаСца (Италия) с перфорацией. Пробы наносят при помощи ампликатора этой же фирмы. Окраску электрофореграмм проводят 0,57"ным раствором Алциан синего в ЗЙ-ном растворе СН,СООН или 0,27.- ным раствором толуидина в 2 Х-ном СНСООН с последующей отмывкой фона 1 Х-ным раствором СН СООН, а затем водой. В качестве стандартов ГАГ используется хондроитин-сульфат "Ваша" (США), гиалуроновая кислота, полученная из стекловидного тела кролика, и гепарансульфат из печени крысы.Электрофоретические исследования ГАГ, выделяемых из лейкоцитов крови, свидетельствуют о том, что они представлены в основном хондроитинсульфатом, об этом также говорят данные определения гексозаминов, сульфата и уроновых кислот и их соотношение. Тот факт, что ГАГ расщепляются тестикулярной гиалуронидазой без образования свободного ацетилгексозамина, свидетельствует о том, что ГАГ лейкоцитов представлены хондроитинсульфатом.Предлагаемый метод выделенич ГАГ из лейкоцитов .крови позволяет значительно ускорить и упростить процедуру выделения ГАГ (сокращается время - выделения от 13-14 до 4 сут; исключается стадия диализа, сокращается время протеолиза с 2-3 сут до 4 ч и т.д,). Кроме того, в предлагаемом методе не используются дефицитные реактивы, в частности проказы,Предлагаемый метод позволяет получить целевой продукт в более очищенном виде, об этом сзидетельствуют данные электрофоретического анализа,Вазработанный способ выделения ГАГ из лейкоцитов крови позволяет проводить исследования количественного содержания ГАГ, их состава в клетках крови здоровых людей и больных лейкозами.