Способ получения эритроцитарного диагностикума

(9) 01) СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 4(51) А 61 К 39/ ГОС дПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ НОМЪ СВИДЕТЕЛЬСТ"ФСС; Д А 28-1 ИТРО Бюл. Ува, И.В.и Г.Ф. Тимный научн ли енк о-исследо итут эпндемиолог аучно-исследоват нерологический и и ль -сти(088.8)амеыты на изготов и столбнячного э гностикумов Ф 12- 15-16, 24.04,74 ( ени итро3. тотип) АРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР АМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(21) 3558529 (22) 25.02,8 (46) 23.,02.8 (72) Н.Н,Бас В.Н. Беднова (71) Централ тельский инс Центральный ский кожно-в тут(53) 615.373 (56) 1. Регл дифтерийного цитарных диа ТУКВС В(54)(57) 1, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА путем стабилизации эритроцитов, обработки ихдубильной кислотой с последующейсенсибилизацией, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повьппения выхода целевого продукта, стабилизированные эритроциты и нестандартныедиагностикумы сенсибилизируют гомологичным сенситином, предварительнообработанным сульфосалициловой кислотой, взятой в концентрации. 0,150,8 мг на 1 мл сенситина.Изобретение относится к биологиии медицине, преимущественно к иммунодиагностике и иммунохимии, и можетбыть использовано в производствеэритроцитарных диагностикумов различной специфичности и в научных исследованиях.Известен способ получения эритроцитарного диагностикума путем стабилизации эритроцитов, обработки их дубильной кислотой с последующей сенсибилизацией 13.Однако известный способ не позволяет получать однородные по качеству серии циагностикумов. 15Целью изобретения является цовышение выхода целевого продукта,Указанная цель достигается тем,что согласно способу получения эритроцитарного диагностикума путем стабилизации эритроцитовобработки ихдубильной кислотой с последующейсенсибилизацией, стабилизированныеэритроциты и нестандартные диагностикумы,сенсибилизируют гомологичным сенситином, предварительно обработаннымсульфосалициловой кислотой, взятой вконцентрации 0,15-0,80 мг на 1 мл сенситина,Ю30Способ выполняется следующим образом.Для приготовления эритроцитарных диагностикумов (дифтерийного, столбнячного трепонемного) могут быть ис 135 пользованы стабилизированные эритроциты млекопитающих, птиц, не подвергавшихся ранее сенсибилизации белковыми или другими сенситинами, а также представпяющие собой производст 40 венный брак (серии, слабые сразу после изготовления или утратившие активность.в результате хранения) .1Стабилизированные эритроциты под-вергают последовательно процедуре ф 5 отмывания (солевые растворы с детергентом, например твин, в концентрации от 1: 10000 до 1:100000), затем обрабатывают веществами-присоединителями, например, дубильной кислотой 50 (от 1: 10000 до 1:80000, преимущественно 1:20000), при 20-37 С в тече- . ние 20 мин - 12 ч с последовательным отмыванием. 0,85 Е"ным раствором хлорида натрия, рН = 5,9-6,4, 55Подготовленные эритроциты суспенди-, руют в забуференном 1: 100 ( 1(15 М фосфатного буфера) 0,857-ном растворе хлорида натрия при рН = 5,9-б,4 до концентрации 2,5-57Эту взвесь соединяют с эффективной дозой сенситина, установленной в предварительном опыте, и смесь инкубируют при 37-45 С в течение 3-5 ч. По истечении этого срока к каждой смеси добавляют формальдегид (до 17-ной концентрации в объеме). Последующее отмывание сенсибилизированных эритроцитов и хранение готового препарата производят в присутствии 17-ного формальдегида.Готовые препараты испытывают в РПГА со стандартной диагностической сывороткой для определения специфической активности.Сопоставление условий сесибилизации показало, что в пределах рН = = 5,9-б,4 обеспечивается наиболее эффективное присоединение сенситинов, например, дифтерийного,столбнячного или сониката патогенных бледных трепонем,что проявляется наивысшими титрами соответствующих стандартных сывороток в РИГА При этом эффективная концентрация сенситина обеспечивает достижение .максимальной активности полученного диагностикума как из 2,57.-ной так, из 57-ной взвеси подготовленных эритроцитов, а получение трепонемного эритроцитарного диагностикума возможно при использовании полученного известным способом в экспериментальных условиях ультразвукового антигена в дозе 0,2 мг белка на 1 мл взвеси эритроцитов. Повышение дозы сенситина от 0,2 До 2 мг белка на 1 мл взвеси эритроцитов способствует повьппению активности диагнос 1 икума на 2"3 раз., ведения (1:2 п), дальнейшее. же повышение дозы белка снижает активностьполученной серии диагностикума, Кроме того, обработка веществами-присоединителями (например, дубильнойкислотой) может производиться с равным успехом в течение 30 мин -16(18) ч при 20-37 С, причем сенситиы перед присоединением к подготовленным эритроцитам обрабатывают сульфосалициповой кислотой в дозе, обеспечивающей стойкую опалесценцию конкретного белкового коллоида.П р и м е р 1. Для приготовления дифтерийного или столбнячного эритро" цитарных диагностикумов формалинизированные эритроциты барана,не под35 П р и м е р 3. Для приготовления трепонемного эритроцитарного диагно- . стикума формалинизированные эритроциты барана, ранее не подвергавшиеся сенсибилизации, последовательно обрабатываютаналогично примерам 1 и 2 до этапа сенсибилизации.Полученный известным способом в 55 экспернментальных условиях соникат патогенных бледных трепонем стандарти;зируют цо содержанию белка (метод вергавшиеся ранее сенсибилизации, по= следовательно отмывают 0,857.-ным раствором хлорида натрия, затем - раство-ром детергента (например, твина - 80) . и снова 0,857-ным раствором хлорида натрия. Полученный осадок ресуспендируют и соединяют с раствором глютарового альдегида. После контакта осадок ресуспендируют, осаждают. центрифугированием, осадок снова ресуспендиру ют, отмывают 0,857-ным раствором хлорида натрия, вновь ресуспендируют в.изотоническом растворе хлорида натрия., в котором содержится дубильная кислота. После взаимодействия эритроциты осаждают, осадок промывают 0,857.-ным раствором хлорида натрия с детергентом (твином), затем - без детергента, Сенситин прогревают при 65 С в течение 1 ч и быстро охлаждают при 0 С (вода сольдом) . Затем к нему по каплям постепенно добавляют 1%-ный раствор сульфосалициловой кислоты до появления стойкой опалесценции. 25Ресуспендированные эритроциты, подготовленные, как описано ранее, соединяют с обработанным гомологичным сенситином и помещают на 5 ч в водяную баню при 45 С. По истече нии этого срока к каждой смеси добавляют формальдегид до 17-ной концентрации в объеме, Последующее отмывание сенсибилизированных эритроцитов и хранение готового препарата производится в присутствии 17-ного формальдегида.П р и м е р 2. Для приготовлення дифтерийного или столбнячного эритроцитарных диагностикумов фор 40 малинизированные эритроциты барана, ранее подвергавшиеся сенсибилизациидифтерийным или столбнячным анатоксинами, последовательно обрабатывают аналогично примеру 1 с использовани 45 ем одноименного сенситина - дифтерийного или столбнячного. Лоури) и применяют в качестве сенситина в концентрации, соответствующей0,2 мг/мл на 1 мл 2,57-ной взвесиподготовленных эритроцитов, взаимодействие с которым происходит в присутствии забуференного 1:100(1/15 М фосфатного буфера) 0,857. -ного раствора хлорида натрия (рН5,9) в течение 40 мин при 38 СП р и м е р 4. Для приготовлениятрепонемного эритроцитарного диагностикума формалинизированные эритроциты барана, ранее не подвергавшиесясенсибилизации, последовательно обрабатывают, как в примерах 1 и 3,но для сенсибилизации используютсенситин с концентрацией белка2 мг/мл на 1 мл 2,57.-нсй взвеси подготовленных эритроцитов (рН = 6,4)в течение 45 мин при 38 С.П р и м е р 5. Для приготовления трепонемного эритроцитарногодиагностикума формалинизированныеэритроциты барана, ранее не подвергавшиеся сенсибилизации, последовательно обрабатывают как в примере 1 и 3,но для сенсибилизации используютсенситин с концентрацией белка0,2 мг/мл на 1 мл 57-ной взвеси подготовленных эритроцитов (рН = 6,4)в течение 40 мин при 37 С,П р и м е р 6. Для приготовления трепонемного эритроцитарногодиагностикума формалинизированныеэритроциты. барана, ранее не подвергавшиеся сенсибилизации, последовательно обрабатывают, как в примере1 и 3, но для сенсибилизации используют сенситин с концентрацией белкаЦ2 мг/мл на 1 мл 5 Х-ной взвеси подготовленных эритроцитов (рН = 5,9)в течение 30 мин при 38 С,По предлагаемому способу былиподвергнуты повторной обработке4 л 720 мл взвесей эритроцитов активностью 0006 00015 АЕ/мл 912которых сохранили этот показательв течение 12-18 месяцев.При сравнении 15 серий столбнячного анатоксина ранее можно былорасчитывать на пригодность из них2-3, а по новой технологии было получено 10 серий препарата с активностью 0,006 (2); 0,003 (3); 0,0015,36 серий дифтерийных анатоксиновразного производства 25 оказалисьпригодными для получения высоко чув 1140788ствительных диагностикумов активностью 0,006-0,0002 АГ/мл. Кроме того, 6 л 170 мл (650 серий) дифтерий- ного диагностикума и 5 л 950 мл (720 серий) столбнячного диагностикума было получено с помощью воздействия сульфосалициловой кислотой, причем активность препарата значительно превысила обычные показатели: 0,0008-0.0002 АЕ/мл (дифтерийный), 0,003-0,0008 АЕ/мл(столбнячный). Сроки сохранения активности для 897 серий превысили 12 месяцев, Эти коли чества препарата в условиях постановки РПГА микрометодом обеспечивают обследование более 300 тыс.человек. Применение сульфосалициловой кислоты позволило присоединить к стабилизированным эритроцитам через танин или глютаровый альдегид и танин ранее не присоединявшийся антиген - соникат патогенных бледных трепонем - и приготовить 19 серий нового диагностического препарата. Титры анти- . тел в РПГА с. трепонемным эритроцитарным диагностикумом колеблются от 1:64 до 1:1024 при ранних формах сифилиса и от 1:2000 до 1:32000 при поздних формах этого заболевания. Диагностикум сохранял свою активность в течение 3 мес (срок наблюдения),П р и м е р 7. Для приготовления дифтерийного или столбнячного эритроцитарного диагностикума формалинизированные эритроциты барана или нестандартные серии эритроцитарных диагноСтикумов последовательно обрабатывают, как в примере 1, с использованием одноименного .сенситина, предварительно обработанного сульфосалициловой кислотой, взятой в концентрации 0,15 мг на 1 мл сенситина.П р и м е р 8, Для приготовления дифтерийного или столбнячного эритроцитарного диагностикума формалинизированные эритроциты барана или нестандартные серии эритроцитарных диагностикумов последовательно обрабатывают,. как в примере 1, с использованием одноименного;сенситина, предварительно обработанного сульфосалициловой кислотой, взятой в концентрации 0,2 мг на .1 мл сенситина.П р и.м е р 9, Для приготовления дифтерийного или стоблнячного эритроцитарного диагностикума форма. линизированные эритроциты барана или нестандартные серии эритроцитарных диагностикумов последователь но обрабатывают, как в примере 1,с использованием одноименного сенситина, предварительно обработанного сульфосалициловой кислотой, взятой в концентрации ОЯ мг 1 мл сенситина.П р и м е р 10, Для приготовления дифтерийного или столбнячногоэритроцитарного диагностикума формалинизированные эритроциты баранаили нестандартные серии эритроцитарных диагностикумов последовательно обрабатывают, как в примере 1,с использованием одноименного сенситина, предварительно обработанногосульфосалициловой кислотой, взятойв концентрации 0,85 мг на 1 мп сенси.тина,По предлагаемому способу былисенсибилизированы формалинизированные эритроциты и нестандартные диагностикумы дифтерийным или столбнячным анатоксином, предварительно обработанным сульфосалициловой кислотой, взятой в концентрации 0,150,85 мг на 1 мл анатоксина. Сопостав 30,ление полученных результатов данов таблице,Таким образом, предлагаемый способ производства или экспериментального приготовления эритроцитарных диагностикумов повышает возможности использования формалинизированных эритроцитов из числа отбракованных серий за счет повторной обработки, а также позволяет использовать в ка честве сенситинов дополнительныесерии коммерческих полуфабрикатов вакцин, сывороток для изготовления эритроцитарных диагностикумов высо кой специфичности и чувствительнос тифПредлагаемый способ приготовления эритроцитарных диагностикумовобеспечивает по сравнению с известным способом возможность повторного 50 использования формалинизированныхэритроцитов (утилизации производственного брака и серий, вышедшихиз срока годности) путем повторнойих обработки веществом-присоедини телем и одноименным сенСИтином, использования в 6-8 раз большего числа производственных образцов полуфаб- рикатов сенситинов (например, ана/ формалинизированный 1080 52 68,5 70,3 65,6 43,1 Столбнячный эритроцитарный 225 50,2 60,1 67,6 58,9 47,0 Дифтерийный нестандартный 720 59,0 72,3 75,6 68,4 53,4 340 64,3 74,0 83,5 79,0 61, 1 Столбнячный Составитель П.БонарцевРедактор Н. Лазаренко Техред Т.Маточка Корректор В, Бутяга Заказ 360/5 Тираж 722 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Подписное Филиал ППП "Патент",г. Ужгород, ул. Проектная, 4 токсинов) для получения эритроцитарных диагностикумов высокой специфичности и чувствительности засчет обработки белковых коллоидовсульфосалициловой кислотой, а также возможность присоединения к эритроцитам ряда веществ белковой природы, в том числе полученных в экспериментальных условиях, не сенсибилизирующих эритроциты известнымспособом, например сониката патогенных бледных трепонем, при изготовлении эритроцитарного диагностикума этой специфичности. Выход стандартных серий препарата, 7,при концентрации сульфосалициловой кислоты, мг/мл 0,15 0,2 0,6 0,8 0,85