Способ получения конъюгатов полициклических ароматических углеводородов с белками

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 09) И) 4(51) А 61 К 39 0 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЭОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛВСТВУ(71) Научно-исследовательский институт по.биологическим испытаниям химических соединений(56) 1МейЬодз и епгущо 1 оцу. Хед. Со 1 оисс . Р., Кар 1 ап й. О., 876,ч, 44, МУ, .опдоп, р. 53-65.2. СгеесЬ Н 1 7 опцз В. К. ТЬе соп цдайоп о 1 Ногзе Ьегцв Д 1 Ьцаи ИйЬ зосуапайез.оТ Сегдаи Ро 1 упцс 1 еаг Агоаайс НудгосагЬопз.д. Ааег., СЬев., 5 ос. 63, 1941,6, р. 1661-1669.(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЮ КОНЬЮГАТОВ1 ОЛИЦИКЦИЧЕСКИХ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ С БЕЛКАИИ, включающий активацию углеводородов и их ковалентноесвязывание с белками, о т л и ч а -ю щ.и й с я тем, что, с целью упрощения процесса получения целевогопродукта, активацию углеводородовпроводят в присутствии белка, солейдвухвалентного железа и перекиси водорода при соотношении компонентов1:5:0,06:5,4 - 1:5:2:20 соответственно или белка, пероксидазы и перекиси водорода при соотношении компонентов 1:1,5:0,3:0,35 - 1:5:5:12 прирН 7,4-8,0. , Е1 11394Изобретение относится к иммунохимии, конкретно к способу полученияконъюгированных антигенов (полициклический ароматический углеводород "антигенный носитель), которые могут5найти применение в медицине и биологии для получения антител к канцерогенным полициклическим ароматическимуглеводородам (ПАУ), нейтрализацииканцерогенного действия ПАУ и дляопределения концентрации и локализации ПАУ в жидкостях и тканях организма.Известны способы получения коньюгатов белков с различными полимерами Ц.Однако они не предназначены длясвязывания белков с растворимым ПАУ.Наиболее близким к изобретениюпо технической сущности к достигаемому положительному эффекту являетсяспособ получения конъюгатов полициклических ароматических углеводородовс белками, включающий активацию углеводородов и их ковалентное связывание с белками, Активация углеводородов заключается в получении изоцианатных производных,и их отделенииот реакционной смеси, затем изоцианатные производные углеводородов вво 30дят в реакцию с белками 2.Неостатками этого способа являютсядлительность и трудоемкость процесса,Реакционноспособное производное ПАУполучают в несколько стадий. В ходесинтеза необходима очистка промежуточных производных, применение большого .количества растворителей, концентрированных кислот и токсичныхвеществ (фосген),40Целью изобретения является упрощение процесса получения целевогопродукта.Поставленная цель достигается тем,способом получения конъюгатов полициклических ароматических углеводоро 45дов с белками, включающим активациюуглеводородов и их ковалентное связывание с белками, активацию углеводородов проводят в присутствии белка, солей двухвалентного железа иперекиси водорода при соотношениикомпонентов 1:5:0,06:5,4 - 1:5:2:20соответственно или белка, пероксидазыи перекиси водорода при соотношениикомпонентов 1:1,5:0,3:0,35 - 1:5:5:1255при рН 7,4-8,0.Сущность. способа заключается виспользовании для активации свобод 38 2ных радикалов. Реактив Фотона (смесьсолей двухвалентного железа и перекиси водорода и пероксидаза генерируют гидроксильный или супероксиданионный радикалы, способные окислять игидроксилировать различные органичес.кие соединения. В присутствии этихреагентов углеводороды связываютсяковалентно с антигенным носителем.Различие между двумя вариантами заключается только в том, что для гене. рирования свободных радикалов во вто. ром случае используется,не реактив Фентона, а фермент.При осуществлении способа по первому варианту к водному раствору бел кового антигенного носителя (рН 5-8), добавляют углеводород, соль двухвалентиого железа и перекис водорода в указанном соотношении. Смесь перемешивают при 0-25 Со втечение 24 ч, Полученный конъюгированный антиген очищают фйльтрацией и гель-хроматографией на сефадексах.1 Содержание углеводородов в конъюгированных антигенах определяют спектрофотометрически по интенсивности4 поглощения в области 30000-24000 смпо сравнению с эталонными растворами ПАУ. В зависимости.от соотношения ,компонентов реакции получают конъюгированные антигены, содержащие 1- 14 моль ПАУ на 1 моль белка.Для получения конъюгированных антигенов ПАУ-антигенный носитель по второму варианту предлагаемого способа к 0,5 Х-ному водному раствору антигенного белкового носителя (рН 7-8) по каплям при перемешивании вносят раствор ПАУ в диоксане, водный раствор пероксидазы хрена и перекись водорода в указанном весовом соотношении, Смесь перемешивают прн 0- 25 С в течение 10 мин, затем очищают от ннзкомолекулярных продуктов реакции и пероксидазы хрена хроматографией на акрилексе П. Количество ПАУ в конъюгированном антигене определяют спектрофотометрически по интенсивности поглощения в области 30000-24000 см . В зависимости от соотношения компонентов реакции получают конъюгированные антнгены, в которых с одной молекулой белкового носителя ковалентно связаны 1-2 молекулы ПАУ.При осуществлении предлагаемого способа, по сравнению с известным достигается значительное упрощение тех.438 4 з 1139 нологии (проведение реакции в одну стадию вместо четырех без очистки и выделения промежуточных продуктов, исключение целого ряда реагентов и растворителей, убыстрение процесса в 3-5 раэ). Это возможно в результате использования нового приема активированпя ПАУ для присоединения их к белку, которое. осуществляется непосредственно в присутствии белка, беэ1 О вьщеления промежуточного реакционно- способного производного ПАУ. Соотношения ПАУ, белкового носителя и веществ, используемых для активирования ПАУ (реактив Фентона или перок 15 сидаза хрена в смеси с перекисью водорода), выбрано в таких пределах, при которых образуется конъюгированный антиген оптимального качества, т.е. содержащий 2-20 моль ПАУ на 1 моль белка. При меньшем количестве20 1 ИУ в конъюгатеухужшаются его анти- генные свойства, при большом замещении возможны нежелательные побочные эффекты при иммунизации животных, кроме того, ухудшается раство 25 римость конъюгатов. Выбранный интервал температур и величина рН позволяют проводить реакцию конъюгирования с достаточной скоростью при стабильности белкового носителя.30П р и м е р . Способ получения конъюгированного антигена метилхолантрен-бычий сывороточный альбумин.50 мг бычьего сывороточного альбу мина растворяют в 2 мл фосфатного 35 буфера рН 7,4 и 3 мл воды, добавляют О мг (3810 М) метилхолантрена, 0,63 (5 1 О М)Ее 5047 Н 20 и 0,165 мл 1,32 1 О М ЗЗЖ-ной перекиси водорода. Смесь перемешивают при комнатной 40 температуре в течение 24 ч. Полученный конъюгированный антиген метилхолантрен - бычий сывороточный альбумин очищают фильтрацией и гель-хроматографией на сефадексе 6-25. С одной 45 молекулой белка в конъюгате по данным спектрометрии ковалентного связано 14 молекул метилхолантрена.П р и м е р 2, Способ получения конъюгированного антигена метилхолан трен бычий сывороточный альбумин.50 мг бычьего сывороточного альбу- мина растворяют в 3 мл воды и 2 мп ацетатного буфера рН 8,0, К раствору добавляют метилхолантрен, соль железа 55 и перекись водорода в соотношении, указанном в примере 1, дальнейшую обработку реакции проводят аналогично примеру . Получают конъюгированный антиген, в котором с одной моле. кулой белка ковалентно связаны 2 мо лекулы метилхолантренаП р и м е р 3. Способ получения конъюгированного антигена метилхолан,трен - человеческий сывороточный альбумин.50 мг человеческого сывороточного альбумина растворяют в 3 мл воды и 2 мл фосфатного буфера рН 7,4. К раст вору добавляют 10 мг (3810 М) метилхолантрена, 20 мг (1,6 10 М) Ге 507 Н 20 и 0,6 мл (510 3 М) ЗЗЖ- ной перекйси водорода. Смесь перемешивают 24 ч при комнатной температуре, после очистки на сефадексе 6-25 получают конъюгат, в котором с одной молекулой белка ковалентно связа но 5 молекул метилхолантрена.П р и м е р 4. Способ получения конъюгированного антигена метилхолантрен - бычий сывороточный альбумин.15 мг бычьего сывороточного альбу. мина растворяют в 2.мл фосфатного буфера, рН 7,4 и по каплям при перемешивании добавляют раствор 3 мг метилхолантрена в 0,1 мл диоксана. К полученной смеси добавляют 15 мг пероксидазы хрена в 0,5 мл фосфатного буфера и 1 мл 3,5 Е-ной перекиси водо. рода, Реакционную массу перемешивают О мин при комнатной температуре, образовавшийся конъюгат очищают на акрилексе П. По данным спектро- фотометрии полученный конъюгат метил. холантрен - бычий сывороточный альбу. мин содержит 2 моль метилхолантрена на 1 моль белка.П р и м е р 5. Способ получения конъюгированного антигена бензпирен . бычий сывороточный альбумин.К раствору 15 мг бычьего сывороточного альбумина в 3 мл фосфатного буфера рН 7,4 добавляют 10 мг (4,210 5 И) 3,4 бенэпирена в минимальном количестве диоксана, 3 мг пе" роксидаэы хрена в 0,5 мл фосфатного буфера и 0,5 мл (3О 4 М) 3,5 Ж-ной перекиси водорода. Смесь перемешивают 10 мин и очищают конъюгированный антиген бензпирен - бычий сывороточный альбумин хроматографированием на акрилексе П. По данным Уф-спектра в полученном конъюгате.2 моль бензпи рена связаны с 1 моль белка.П р и м е р 6. Способ получения конъюгированного антигена бензпиренчеловеческий сывороточныи альбумин,1Составитель И. ПриваловРедактор Н, Швыдкая. Техред Т.Фанта Корректор И. Эрдейи Тираж 722 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035; Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Заказ 1 бЭ/4 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная. 4 3К раствору 15 мг человеческого .сывороточного апьбумина в 3 мл фосфатного буфера рН 7,4 добавляют . 10 мг (4,210 М) 3,4-бензпирена в .минимальном количестве диоксана, Э кг пероксидаэы хрена в 0,5 мл фосфатного буфера и 0,1 мл (б ф 10" М) 3,5 .-ной перекиси водорода. Смесь перемешивают 10 мин при комнатной температуре и очищают конъюгированный антиген бензпирен - человеческий сывороточный .альбумин хроматографией на акрилексе П.60. По данныи УФ-спектров в.полученном конъюгированном антигене с 1 моль белка ковалентно связан 1 моль бенэпирена. Таким образом, в предлагаемом способе получения конъюгированных с139438 6белками ПАУ по сравнению с известным существенно упрощена технология процесса. В известном способе конъюгат ПАУ.-белок получают в четыре стадии в течение 10-11 дней, а в данном реакционноспособное проиэнодство ПАУ генерируют в присутствии антигенного носителя, поэтому процесс получения конъюгированного антигена прохо цит в одну стадию в течение 2 дней.Отпадает необходимость выделения и очистки промежуточных производньжу исключается целый ряд реагентов и ра створителей (концентрированные азот-.ная, соляная, уксусная"кислоты, хлорид олова, концентрированный раствор аммиака, бензол, толуол, лигроин); в том числе токсичный реагент - фосген.