Способ получения сорбента

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик и 979354Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытийОпубликовано 07,12.82. Бюллетень йо 45 Дата опубликования описания 07, 12. 82(72) Авторы изобретения Всесоюзный научно"исследовательский институт" прикладной энзимологии.(5,4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА Изобретение относится к области энэимологии и предназначается для получения сорбента для выделения и очистки кофактор-зависимых .Фермен" тов - оксидо-редуказ, киназ и др,Для выделения и очистки кофакторзависимых ферментов наряду с классическими методами широкое распространение получила и методика биоспецифической хроматографии с использованием групповых сорбентов на основе иммобилизованных производных ,кофакторовОднако сорбенты данного типа несмотря на их высокую специфичность обладают существенными недостатками: дороговизной, которую определяет дороговизна используемых для синтеза сорбентов носителей и кофакторов, сложность методов активирования и модифицирования кофакто- . ров, низкая химическая стабильность получаемых сорбентов, что в совокупности исключает возможность использования сорбентов для препаративного выделения и очистки кофак" тор-зависимых ферментов.Более перспективными для препаративного выделения и очистки коФактор-зависимых Ферментов являются сорбенты, содержащие в качестве лиганда красители, структурные аналоги коферментов, и в первую оче редь активный краситель цибакрон голубой РзСЛ. Так, известен способполучению сорбента на основе агароэной матрицы с присоединенньм красителем цибакрон голубым Р СА 1 1 ,.Однако воэможность препаративного использования сорбентов со связанными красителями несмотря на химическую стабильность последних ограничена недостатками используемойдля синтеза сорбентов агарозной матрицы (дороговизна, низкая химическая,микробиологическая и механическаястабильность).Наиболее близким по техническойсущности является способ получениясорбента на основе красителя цибакрон голубого РЗОА и микросферического пористого сйликагеля ЯС 120,включающий активирование носителя-аминопропилтриэтоксисиланом, отдеЛьное от носителя активирование водорастворимого декстрана -40 с ВгСМ в среде бикарбоната йатрия прирН 9,0 в соотношении 50 мг ВгСЯ на200 мг декстрана и модифицированиеносителя ВгСН-активированным декстра 979354ном при рН 9,0 в колонке в соотношении 200 мг декстрана на 1,0 г носителя путем рециркуляции активированного декстрана через колонку в течение 24 ч, промывку модифицированногоносителя, присоединение красителя цибакрон голубого РОА и промывку полученного сорбента водой. Обычно промывку модифицированного носителя осуществляют 1 М раствором ИаСГ и водой 2 .Однако данный способ получения сорбента имеет ряд существенных недостатков. Во-первых, процесс модифицирования активированного неор-. ганического носителя является нетех нологичным и осложняется использованием для присоединения декстрана Т 40 к носителю ВгСИ, который является дорогостоящим, ядовитым и опасным веществом при использовании его в препаративных целях, во-вторых, при использовании для модифицирования неорганического носителя декстрана, активированного ВгСИ, образующаяся связь между носителем и декст раном является химически нестабильной3, что приводит к потере присоединяемого красителя при длительном использовании сорбента и, следовательно, снижению емкости сорбента; в-третьих, существующий метод модифицирования неорганического носителя обеспечивает возможность введения в сорбент 5-10 мкМ красителя на 1 г сорбента и ограничивает тем самым возможность его использования для выделения и очистки тех кофактор-зависимых ферментов, которые обладают низким средством к красителю. С другой стороны, сравнительно не" высокая концентрация вводимого кра сителя влияет и на степень сорбционной емкости сорбента в целом по отношению выделяемых с его помощью белков.45Цель изобретения - упрощение процесса получения сорбента (путем снижения числа стадий, общей трудоемкости процесса, а также исключения ис.пользования ядовитых веществ) и по вышение сорбционной емкости сорбента.,Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения сорбента,включающему обработку неоргани ческого кремнеэемсодержащего материала -аминопропилтриэтоксисиланом и модифицирование полученного производного с последующей промывкой и присоединением активного красителя 60 цибакрон голубого РСА, модифицирование производного проводят в течение 1-2 ч 25-50-кратным избытком глутаральдегида в отношении ЯН -групп обрабатываемого продукта. 65 Активный краситель цибакрон голубой Рэ СА используют в количестве 20100 мкМ/г. обрабатываемого продукта.В качестве неорганического кремнеэемсодержащего материала используют .пористое стекло или силохромсо средним радиусом пор 300-800 А.Промывку модифицированного продукта перед присоединением красителяосуществляют водой, 10-20 объемами0,09-0.,15 М раствора БаНСО, содержащего 0,2-0,3 боргидрида натрия в течение 2-3 ч.Способ обеспечивает возможностьвведения в сорбент 10-40 мкМ красителя на 1 г сорбента, т,е. позволяетповысить его сорбционную емкость,Модифицирование носителя, содержащегоаминогруппы, проводят глутаральдегидом с последующим восстановителем,что способствует образованию стабиль 1ной связи между ним и носителем иобразованию стабильной связи междуприсоединяемым красителем и модифицированным носителем. Метод модифицирования глутаральдегидом являетсядоступным, простым в технологическомоформлении, так как не требует использования труднодоступных и ядовитых веществ, и позволяет подборомсоотношения реагирующих веществ регулировать концентрацию вводимогов сорбент красителя и соответственно сорбционную емкость сорбента вшироком интервале значений, Способявляется более технологичным и простым по сравнению с известным,Неорганическая матрица может бытьиспользована как в виде силохромови пористых стекол с последующимаминированием 3"аминопропилтриэтоксисиланом, так и в виде готовыхМН -содержащих производных, выпускаемйх зарубежными Фирмами и НПОВиохим-реактив. Оптимальное содержание ИН -групп 100-448 мкМ/г.П р и м е р 1. Получение сорбентана основе силохрома С. 10 г силохрома Сзаливают 10 г абсолютногоацетона, вводят 10 г -аминопропилтриэтоксисилана и реакционную смесьперемешивают в течение 24 ч при температуре кипения смеси. Продукт реакции отфильтровывают, промывают4-5 раз ацетоном (по 50 мл) и высушивают. Получают 9,4 г аминопроиэводного силохрома С. 2,3 г силанизированного силохрома С(концентрация ЯН.-групп 120 мкМ/1 г)заливают 5,8 мл 25-ного глутаровогодиальдегида и 2,6 мл воды, перемешивают 1 ч при комнатной температуре, промывают на фильтре водой, затем небольшими порциями (15-20 мл)0,1 М БаНСО (200 мл)содержащего0,2-0,3 йаВН 4 в течение 2 ч и опятьпромывают водой. К влажному глутаральдегидом модифицированйому сило- та, полученного по примеру 1 при исхрому Сприбавляют 3 мл воды и пользовании 25-кратного избытка глупри перемешивании при 60 С вводят таральдегида с концентрацией красипо каплям раствор 252,5 мг (234;8 мкМ) теля 15 мкМ/г сорбента. Сорбентцибакрон голубого ЕьОА в 14,0 мл уравновешивают 10 мМ трис-НСГ буфеводы. Перемешивание продолжают еще ром РН 6,5, содержащим 5 мМ МССР 6 Н О0,5 ч прибавляют 2,25 г НаСВ, пере- и 0,5 мМ ЭДТА, и наносят 1,5 млмешивают 1 ч, затем температуру повы- раствора фермента в исходном буфере.шают до 80 С, прибавляют 200 мг Концентрация белка 6,0 мг/мл, удельБа СОз и перемешивают 2 ч. Полученный ная активность 19,8 ед/мг белка, Присорбент отмывают холодной и горячей элюировании с 50 мл исходного буводой 60-90 С до тех пор, пока про- фера вымываются балластные белки.мывные воды становятся бесцветными. Элюирование гексокинаэы проводят граКонцентрацию красителя на сорбенте диентом хлористого натрия от 0-1,0 Мопределяют по разнице Между взятым в исходном буфере. Удельная активего количеством и найденным в про ность гексокинаэы после десорбциимывных водах, используя теоретичес- в среднем 72 ед/мг. Выход по активкий коэффициент экстинции Е=13600 М ности 98-100. Емкость сорбента.см (Ац, = 610 нм). Концентрация .140 ед/мл.цибакрон голубого Е ОА 37,0 мкМ/г П р и м е р За. В хроматографическую колонку (как в примере 3) загруП р и м е р 2. Получение группо- жают 1,0 мл сорбента, полученногового сорбента на основе пористого по примеру 1 при использовании 25 стекла СРС 550, кратного избытка глутаральдегида сб 7 г силанизированного стеклаВ25концентрацией красителя 40,6 мкМ/гСРО 550 (концентрация ИН-групп сорбента. Сорбент уравновешивают100 мкМ/г) заливают 6,7 мл 25-ного буфером (как в примере 3) и наноглутаральдегида, прибавляют 23,3.мл сят 2,0 мл раствора фермента в исводы и перемешивают 1 ч при комнат- ходком буфере. Концентрация белканой температуре, промывают на фильт,8 мг/мл, удельная активностьре водой, затем 400 мл 0,1 М БаНСОЗ З 0 16,5 ед/мг белка. При элюции 100 мл(порциями по 30-50 мл), содержаще- исходного буферного раствора вымыго 0,2-0,3 БаВН 4,в течение 2 ч водой. вают балластные белки; Активная гекК влажному модифицированному стеклу сокиназа десорбируется линейным граприбавляют 10 мл воды и при пере- диентом хлористого натрия от 0 мешивании при 60 С вводят по каплям 35 1,0 М в исходном буФере, Удельная акраствор 660, 1 мг (613,9 мкМ) ци-тивность гексокинаэы после десорбциибакРон голУбого Рз СА, Далее Реакцию 82,0 ед/мг белка, выход по активноспроводят по примеру 1, но количество ти 100. Емкость сорбента 225 ед/мл.прибавляемых БаС 6 и НаСОЗсоотве П р н м е р Зб. В хроматографивенно 5,5 г и 493 мг. о ц р цческую колонку (как в примере 3) эаон гол бого 25 мкМ/г сухогогружают 1,0 мл сорбента, полученного сорбента.по примеру 1 при использовании 50 п е елеиия пригодности соркратного избытка глутаральдегида сбентов для очистки кофактор-з концентрацией красителя 15 мкМ/гсимых феРментов испол эую сорбента, уравновешивают исходным бументов используют базовыйпрепарат дрожжевой г ф фером и наносят 1 мл раствора гексот ожжевой гексокиназы, полученный после автолиз рсле автолиза пекарскихкиназы с концентрацией белка8,8 мг/мл и удельной активностьюния, двухкРатного фракционирова" 16,4 ед/мг белка. При элюировании ссульфатом аммония, диализа и лиофиль 50 80 мл исходного буфера вымываются ной сушки, согласно нача нгласно начальным стабалластные белки, Активная гексокидиям схемы очистки фермента по меназа десорбируется линейным градитодике 4 ) и базовый пРепарат дрож- ентом НаСГ от 0-1,0 М в исходномжевой алкогольдегидроль еги огеназы, полуб фере. Удельная активность гексоки 55 назы после десорбции в среднемвтолиэа д ожжей, тер- у еония д 80 ед/мг белка, выход по ктивностнаботки фракционирования.(:Ульфатом аммония, дония диалиэа и лиофиль 100, Емкость сорбента 142 ед/мл, ной сушки согласно нгласно начальным стадиямП и м е Зв. В хроматографит ике ( 5 ",. Удельная активность р и м е р по методике",. дческую колонку (как в примере 3) эаокиназы 0 / б для 60 гружают 1 мл сорбента, полученногоментов в среднем 10-25 ед/мг длягексокиназыокинавы и 5-10 ед/мг белка дляпо примеру 1 при использовании 50- алкогольдегидрогеназы.П и м е р 3. Очистка дрожжевой кратного избытка глутаральдегида сП р и м е р . чисконцентрацией красителя 370 мкМ/гф ую колонку сорбента, уравновешивают исходнымВ хроматографическую колонк(1,0 5,0 см) загружают 1 0 мл сорбен буфером и наносят 1,5 мл растворагексокиназы с концентрацией белка8,5 мг/мл и удельной активностью21,1 ед,/мг белка. При проведениихроматографии в условиях идентичных примеру 3 удельная активностьФермента 69 ед/мг белка с выходомактивности 72. Емкость сорбента224,5 ед/мл.П р и м е р Зг. В хроматограФическую колонку (как в примере 3)загружают 2,8 мл сорбента, полученного на основе пористого стекла(как в примере 2) с использованием50-кратного избытка глутаральдегидаи концентрацией красителя 15 мкМ/1 гсорбента. После уравновешивания сорбента исходным буфером наносят 3 млраствора гексокиназыс концентрацией белка 9,6 мг/мл и удельной активностью 33 ед/мг белка При проведении хроматографии в условиях идентичных примеру 3 удельная активностьдесорбированного фермента достигает150 ед/мг белка с выходом активности 80. Емкость сорбента 333 ед/мл,П р и м е р 4. Очистка дрожжевойалкогольдегидрогеназы.В хроматографическую колонку(1,53,0 см), заполненную 2,0 млсорбента, синтезированного (как впримере 2) с использованием 25-кратного избытка глутаральдегида с концентрацией красителя 15 мкМ/г сорбента, и уравновешенную 10 мМ трисНСС буфером рН 6,5, содержащим .5 мм МдСЕ -6 Н,О, 0.,5 мМ ЭдтА и 0,05 мммеркаптоэтаноля, наносят 3,0 мл ферментного раствора алкогольдегидрогенаэы. Концентрация белка 14,7 мг/мл,удельная активность 7,9 ед/мг белка.При промывании колонки исходным буФером (140 мл) вымываются балластныебелки. Элюирование фермента осуществляют специфически линейным градиентом НАД от 0-10 мМ (50 МЛ) в иеходном буфере. Активная алкогольдегидрогенаэа десорбируется при 3 мМ НАД судельной активносгью 120 ед/мг белкаи выходом активности 47. Сорбционная емкость сорбента 140 ед/мл сорбента.П р и м е.р 4 д. В хроматографическую колонку (как в примере 4), заполненную 1 мл сорбента, полученно. го на основе силохрома С(как в, примере 1) с использованием 25-кратного избытка глутаральдегида с концентрацией красителя 15 мкМ/г, урав новешенную исходным буфером, наносят 2 мл раствора алкогольдегидрогеназы с удельной активностью 7,6 ед/мг белка и концентрацией белка 10,6 мг/мл. При промывании 60 мл исходного буфе ра вымываются балластные белки. Элюирование алкогольдегидрогенаэы проводят линейным градиентом НАД от 0-10 мМ в исходном буфере. Активный фермент десорбировался при 5 мМ НАД с удельной активностью 55 ед/мг белкаи выходом активности 48.Емкость сорбента 120 ед/мл сорбента,П р и м,е р 4 Д. В хроматографическую колонку (как в примере 4), заполненную 1 мл сорбента, полученного на основе силохрома С(какв примере 1) с использованием 25 кратного избытка глутаральдегида сконцентрацией красителя 40,6 мкМ/г,уравновешенную исходным буфером, наносят.2,0 млраствора алкогольдегидрогеназы с концентрацией белка11,6 мг/мл и удельной активностью8,3 ед/мг белка. После промывания60 мл исходного буфера вымываютсябалластные белки. Элюирование алкогольдегидрогеназы проводят линейнымградиентом НАД от 0-10 мМ в исходном буфере, Активная алкогольдегидро 20 геназа десорбируется при 5 мМ НАДс удельной активностью 140 ед/мгбелка. Сорбционная емкость сорбента130 ед/мл сорбента.П р и м е р 44. В хроматографи 25 ческую колонку (как в примере 4),заполненную 1 мл сорбента, полученного на основе силохрома С(как в примере 1) с использованием50-кратного избытка глутаральдеги 30 да с концентрацией красителя15 мкМ/г, уравновешенную исходнымбуфером, наносят 2 мл раствораалкогольдегидрогеназы с удельнойактивностью 7,6 ед/мг белка и кон 35 центрацией белка 10,6 мг/мл. Послевымывания балластных белков с 60 млисходного буфера активная алкогольдегидрогеназа десорбируется линейнымградиентом НАД от 1-10 мМ в исходном40 буфереУдельная активность Фермента,десорбируемого с 4 мМ НАД 110 ед/мгбелка свыходом активности 43. Ем,кость сорбента 90 ед/мл сорбента.П р и м е р 4. В хроматографи 45 ческую колонку (как в примере 4),заполненную 1,0 мл сорбента, полученного на основе силохрома С.с концентрацией красителя 37 мкМ/г,наносят 2 мл раствора алкогольдегидрогеназы с удельной активностью7,6 ед/мг белка и концентрацией белка 10,6 мг/мл. При проведении хроматографии аналогично примеру 4-48алкогольдегидрогеназа десорбируетсяпри 5 мМ НАД с удельной активностью115 ед/мг белка и выходом активности 41. Емкость сорбента 112 ед/мл,Предлагаемый способ получениягруппового сорбента на основе модиФицированного неорганического носителя и красителя цибакрон голубогоРд СА обеспечивает по сравнению сизвестными способами получения сор 65,бентов следующие преимущества. Вы979354 10 формула изобретения Составитель О.СкородумоваРедактор О.Колесникова Техред А.Ач Корректор В.Прохненко Заказ 9270/2 Тираж 388 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 сокую эффективность сорбента по отношению кофактор-зависимых ферментов, т,е. возможность повышения удельной активности очищаемых Ферментовза одну стадию сорбции - десорбции всреднем 4-15 раэ с сохранением активности Фермента на 40-100. Сорбент, получаемый по предлагаемомуспособу, обладает высокой объемнойсорбционной емкостью ферментов, составляющей 90-330 ед. активности/мл 10сорбента, Доступность исходных веществ, необходимых для полученияосмента, простота и доступностьметода. получения сорбента обеспечивают воэможность внедрения технологии синтеза в производство для выпуска укрупненных партий сорбента. Совокупность перечисленных преимуществ определяет эффективность ис пользования предлагаемого способа получения сорбента для его промышленного производства и использования в технологии получения высокоочищенных кофактор-зависимых Ферментов. 1. Способ получения сорбента, ЗО включающий обработку неорганического кремнеземсодержащего материала 3-аминопропилтриэтоксисиланом, модифицирование полученного производного с последующей промывкой и.присоединением активного красителя цибакрон голубого РОА, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения про цесса и повышения сорбционной емкости сорбента, модифицирование осуществляют в течение 1-2 ч глутаровым альдегидом, взятым в 25-50-кратном избытке по отношению к содержанию НН -групп обрабатываемого продукта.2. Способ по п.1, о т л и ч а ющ н й с я тем, что активный краситель цибакрон голубой ГСА используют в количестве 20-100 мкМ/г обрабатываемого продукта.3. Способ по пп.1 и 2, о т л ич а ю щ и й с я тем, что в качестве неорганического кремйеземсодержащего материала используют пористое стекло или силохром со средним радиусом пор 300-800 А.4. Способ по пп.1-3, о т л ич а ю щ и й с я тем, что промывку модифицированного продукта перед присоединением красителя осуществляют водой, 10-20 объемами 0,09-0,15 М раствора БаНСО содержащего 0,2- 0,3 боргидрида натрия в течение 2-3 ч.. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Вцгде 11 М.И., Сгеепбеу Ь.Ч,"Авег. ЬаЬ.", 1977, 9,78,2, Апйегзоп Р.А., Легч 1 з Ь,Мй 1 п 1 у рцг 1 Е 1 са 1 оп ой ва 1 аейейуйгосепазе апй Гасгае йеЬуйгодепазе йгов й 1 зЬ вцзсбе оп в 1 сгозрЬег 1 са 6 рогоцз сегав 1 с айзогЬеп 1 з",- "В 1 осЬев.Бос.Тгапз.", 1977, 5, .728.3, ТцгКоча У. ЬеаЕаче ой соцрГейаН 1 пап 1, - "Ю.СЬгова 1 одгарпуф, 1978,12, 189.4. "АгсЬ.В 1 осЬев.В 1 орЬуз.", 1973,158, 451-457.5. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энэимологии, М Высшая школа, 1978, 128