Способ определения вируса везикулярного стоматита

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК 09) (11) Э(5 С 12 К 1 04 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯН АВТОР НОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТ 8 ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОЧНРЫТИЙ(71) Владивостокский государственный медицинский институт(56) 1. Руководство по лабораторнойдиагностике вирусных и реккетсиозных болезней. Под ред. П.Ф.Здродовского и М.И.Соколова, М., "Медицина",1965, с, 77-79 (прототип).(54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУСАВЕЗИКУЛЯРНОГО СТОМАТИТА, заключающийся во внесении вирусосодершащейпробы в культуру клеток-мишеней споследующим учетом результатов, о т-л и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью упрощения способа, в качестве.клеток-мишеней используют неактивированные макроАаги зрелых белыхкрыс дикой линии, а учет результатовпроводят по количеству выделенногомакроАагами лизоцима.1129231 2 Изобретение относится к областимедицины, в частности к вирусологии,и может быть использовано для идентификации и количественного определения вируса везикулярного стоматима (ВВС).Известен способ определения вируса везикулярного стоматита, заключающийся во внесении вирусосодержащей пробы в культуру клеток-мишенейс последующим учетом результатов 13.Однако известный способ сложенпри выполнении и требует большихзатрат времени,Цель изобретения - упрощение способа.Указанная цель достигается тем,что согласно способу определениявируса везикулярного стоматита, заключающемуся во внесении вирусосодержащей пробы в культуру клеток-мишеней с последующим учетом результатов, в качестве клеток-мишеней используют неактивированние макрофагизрелых белых крыс дикой линии, а 25учет результатов проводят по количеству выделенного макрофагами лизоцима.Способ выполняется следующим образом. 30Отличительной бсобенностью способа является замена клеток-мишеней;ефибробласты, чувствительные к цитопатическому действию ВВС, замененыперитонеальными макрофагами, способ- З 5ными быстро отвечать на воздействиеВВС выбросом лизоцима. Последниедовольно легко получают из перитонеальной полости крыс, мышей, разводят до оптимальной концентрации 402 х 10 кл/мл и вносят в стерильные6флаконы. После 30 мин микрофаги плот-,но прикрепляются к поверхности посуды, неприлипшие клетки удаляют отмыванием. Период образования монослоя сокращается У 1 вирусосодержащий материал берет ся в любом одном разведении или в неразведенном виде). После идентичного этапа инфицирования клеток-мишеней различными дозами вирусов эффект вирусов может быть учтен уже через 2 ч. При этом учет результата реакции производят по количеству выброшенного лизоцима через 6-8 ч после начала постановки реакции, максимум через сутки, Лизоцим определяют микровариантом по 55 Н.С.Мотавкиной.П р и м е р. Определение количест ва ВВС в реакции выброса лизоцима макрофагами, Перитонеальные макрофаги получают путем смыва средой сгепарином из перитонеальной полостиживотного известным способом, Клеткиподсчитывают в камере Горяева и вводят в стерильные флаконы с плоскимдном по 0,4 мл (в зависимости отобъема дзлакона) в концентрации2 х 10 кл/мл. Через 30 мин инкубацииЬклеток при комнатной температурефлаконы промьвают средой для удаления неприлипших клеток,В опытные флаконы вносят по 0,4 млразличных разведений вируссодержащего материала на 40 мин (табл, 1),В первом контроле в ряд Флаконов смакрофагами вносят двукратные разведения ВВС (исходная доза 10 ТЦД).Вторым контролем являются не обработанные вирусами клетки-мишени,По истечении времени инфицирования флаконы однократно промываюткультуральной средой и заливают тойже средой по 0,4 мл все флаконы.Реакция идет в течение 2 ч при 37 С,после чего производят определениеактивности лизоцима в надклеточнойсреде микрометодом Е.С,Матавкиной.Для этого суточную культуру Мдсгососсцз 1 дзойесгсцз в концентрации300-500 микр. тел/мл смешивают сравным объемом 2 Х расплавленной агарозы и заливают в камеру, состоящуюиз двух фотопластин и П-образнойпрокладки между ними, В застывшемгеле вырезают лунки гель-пробойником, в которые капилляром вносят равные объемы исследуемого на лизоцим материала, Результат на содержание лизоцима учитьвается через 2 чинкубации при 370 во влажной камерепо зоне лизиса тест-бактерий. Максимальное разведение вирусосодержащегоматериала, вызывающее видимый выброслизоцима макрофагами, является титром р акции, Количество ВВС может быть выражено через результат действия различных разведений известного ВВС (контроль Р 1) в единице ТЦДО .Идентификация ВВС в реакции торможения выброса лизоцима макроагами (определение присутствия ВВС в исследуемом материале) . Проводится ме 3тодом в соответствии со схемой, приведенной в табл. 1 с небольшими изменениями (в опыте и в контролеТаблица 1 Макроаги вконцейтрации2 х 10 кл/мл,мл6 Оэ 4 Оэ 4 Оь 4 Ою 4 Оэ 4 Оф 4 Ов 4 Оэ 4 Оэ 4 Оэ 4 Инкубация 30 мин при комнатной температуре, промывка культуральнойсредой Вирусосодержащий материал, мл 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,41:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1::1280 0,4 0,41: 10 1:20 Культуральная среда,мл 0,4 ВВС исходнаядоза 10 ТЦД мл5 Р по 0,4 Инкубация 40 мин при комнатной температуре, промывка культуральной средой 1-2 разаКультуральная среда,мл0,4 0,4 0,4- 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 Инкубация при 37 С 2 ч Постановка микрометода определения лизоцима в надклеточнойсреде в течение 2 ч Учет результата по наличщо лизоцима+П р и м е ч а н и е. Титр реакции представленного результата 1:640,Э 11для спецИАической идентификации . ВВС метод ставится в соответствии со схемой, приведенной в табл. 2 (схема постановки реакции торможения выброса лизоцима микроАагами).Использование предлагаемого способа сокращает время идентификации 29231 4и определения количества ВВС в10 раз, значительно упрощает спб"соб титровання и индентификацииВИС, что предполагает возможность его постановки даже в неспециализированной лаборатории,1129231 Таблица 2 Ингредиенты Опыт Контроль 1 акроФаги в концентрации2 х 10 кл/мл, мл 0,4 0,4 0,4 Инкубация 30 мин при комнатной температуре, промывка средой Вирусосодержащий материал.обработанный в течение 30"60 минрабочей дозой антнсывороткик ВВС, мл 0,4 0,4.Не обработанный антисывороткойвирусосодержащнй материал, мл 0,4 Инкубация 40 мин при комнатной температуре, промывка средой 1-2 раза Культуральная среда, мл . 0,4 0,4 0,4Инкубация при 37 С 2 ч Постановка микрометода определения лизоцима в надклеточной среде втечение 2 ч Учет результата по наличиюлиэоцима П р и м е ч а н и е, Указанный результат свидетельствует о наличииВВС в вирусосодержащем материале. При отсутствии ВВС в вирусосодержащем материале наблюдается отрицательньй результат на лизоцим как в опыте, так и обоих контролях. Редактор О.Колесникова Заказ 9304/20 Тираж 521 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Иосква, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Известный ВВС, обработанный втечение 30-60 мин антисывороткой к ВВС, мл Составитель П.БонарцевТехред. И.Кузьма Корректор И Иуска