Питательная среда для реакции фогес-проскауэра

(19) (11 40414 5 С 12 М 1/2 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ция выяв(54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ РЕАКЦИИФОГЕС-ПРОСКАУЭРА(57) Использование: медицинская микробиология, питательные среды для идентификации энтеробактерий. Сущностьизобретения: питательная среда используИзобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к питательным средам для идентификации энтеробакте рий.Известна питательная среда для реакции Фогес-Проскауэра, включающая в качестве источника азота пептон. в качестве субстрата - глюкозу и буферную соль - калий фосфорнокислый однозамещенный при следующем соотношении ингредиентов, г/л:Пептон 5 ГлюкозаКалий фосфорнокислый однозамещенный (КН 2 РО 4) 5Устанавливают рН 6,9-7,0.Указанная среда недостаточно точно дает возможность дифференцировать энтеробактерии. Это обусловлено тем, что реакФогес-Проскауэра основана нлении различий в конечных продуктах ется с целью повышения чувствительности среды, точности реакции Фогес-Проскауэра, упрощения способа постановки и учета реакции путем замены питательной основы и введения в состав среды индикатора рН, Питательная среда для реакции Фогес-Проскауэра содержит следующие компоненты, г/л: аминопептид 9,0-11,0; глюкоза 11,0- 13,0; калий фосфорно-кислый однозамещенный 9,0-11,0: бромкрезоловый пурпурный 0,192-0,196; поливиниловый спирт 4,0-6,0; дистиллированная вода остальное, Новым является введение в состав среды в качестве питательной основы аминопептида, а в качестве индикатора рН - бромкрезолового пурпурного, 2 табл. метаболизма глюкозы микроорганизмами: смешанно-кислотной и бутиленгликольной ферментации, промежуточным продуктом которой является ацетоин, Для выявления этого продукта к среде необходимо доба вить реактивы: щелочь, которая окисляет ацетоин до диацетила, и а-нафтол, который в присутствии диацетила дает комплекс красного цвета различной интенсивности.Учет реакции после добавления реактивов и перемешивания ведут через 15-20 мин в течение Зб мин, За вто время интенсивноств окраски меняется от сааба-рокового ао ма. в линового и очень т)удно по цвету отдифференцировать слабоп эложительные реакции (розовый цвет) ог отрицательных (бледно- розовы й).Кроме того, при постановке реакции Фогес-Проскауэра и:пользуют реактивы: концентрированную щелочь (40 КОН) ис- нафтол. которые вызывают ожоги. раздра 1740414жают кожу, слизистые оболочки глаз, дыхательных путей,Целью изобретения является повышение чувствительности среды для реакции Фогес-Проскауэра и упрощение проведение реакции,Указанная цель достигается тем, что в среду дополнительно вводят поливиниловый спирт, в качестве индикатора рН - бромкрезоловый пурпурный, а в качестве источника азота - аминопептид при следующем соотношении компонентов, г/л:Аминопептид 9,0-1 1,0 Глюкоза 11,0-13,0 Калий фосфорнокислый однозамещенный(КН 2 Р 04) 9,0-11,0 Бромкрезоловыйпурпурный О. 192-0. 196 Поливиниловый спирт 4,0-6,0 Дистиллированная вода Остальное Изобретение исключает возможность неправильной оценки за счет повышения чувствительности среды путем введения в качестве индикатора рН бромкрезолового пурпурного, а в качестве источника азота - аминопептид.При этом положительная реакция приобретает фиолетовый цвет, а отрицательная - желтый.Кроме того, среда дает возможность учета реакции одномоментно по всем 12 параметрам анализа в то время, как прототип требует дополнительного внесения двух реактивов и времени 30 мин для образования цветности реакции.Среду готовят следующим образом, Взвешивают все компоненты среды, затем приготавливают рабочий раствор, Для этого все ингредиенты при перемешивании доводят до кипения, После этого устанавливают рН раствора 6,95-7,05 с помощью 10%- ного раствора едкого натра под контролем иономера универсального ЭВ, Среду разливают в пробирки по 5 мл и автоклавируют и ри 110 С в течение 30 мин.Среду используют следующим образом. В прозрачные 96-луночн ые полистироловые планшеты наряду с другими субстрат- но-индикаторными средами в один из вертикальных рядов вносят по 0,05 мл полученной среды с помощью дозатора пипеточного. Затем планшет со средами для подсушивания помещают втермостатирующее устройство при 39-40 С на 3-4 ч, Одновременно и роиз водят облучение ул ьтрафиолетовы ми лампами с целью стерилизации, После сушки планшеты герметизируют в полиэтиленовые пакеты иони готовы к применению. Получен 10 ные планшеты в дальнейшем именуют системами мультимикротестов (МУТ-Е),П р и м е р 1, Готовят среду следующегосостава, г/л:5 Аминопептид 9,0Глюкоза 11,0Калий фосфорнокислый однозамещенный(КН 2 РОа) 9,0Бромкрезоловый пурпурный 0,192Поливиниловый спирт 4,0Дистиллированная вода ОстальноеИспытание работы среды в реакции Фогес-Проскауэра проводят с помощью следу 15 ющих штаммов: КеЬзе 1 а рпецгпопа КиЕпсегоЬассег соасае А. Для исключенияложноположительных результатов в контроле используют штаммы ЕзсЬепсЫа со 846и Ргосецз чцдапз Нх 19, Цвет среды в лун 20 ках с положительно реагирующими штаммами остается фиолетовым, а отрицательнореагирующие штаммы изменяю 1 цвет средына желтый,П р и м е р 2. Состав среды, г/л;25 Аминопептид 10,0Глюкоза 12.0КН 2 Р 04 10,0Бромкрезоловый пурпурный 0,192Поливиниловый спирт 4,030 Дистиллированная вода ОстальноеРезультаты испытания с примером 1одинаковы.П р и м е р 3. Состав среды, г/л:Аминопептид 11,035 Глюкоза 13,0КН 2 Р 04 1 1,0Бромкрезоловый пурпурный 0,194Поливиниловый спирт 5,0Дистиллированная вода Остальное40 Результаты испытаний одинаковы спримерами 1 и 2,П р и м е р 4, Состав среды, г/л:Аминопептид 8,0Глюкоза 10,045 КН 2 Р 04 8,0Бромкрезоловый пурпурный 0.190Поливиниловый спирт 6,0Дистиллированная вода ОстальноеРезультаты испытаний показывают50 (табл,1), что при посеве 100 млн,мик,клеток/мл штамм Рготецз чц 1 дапз 19 дал локноположительныл результат. Увеличениепосевной дозы до 500 млн.мик,клеток/млпозволило избежать ложных реакций.55 П р и м е р 5. Состав, среды, г/л:Аминопептид 12,0Глюкоза 14,0КН 2 Р 04 12,0Броглкрезоловый пурпурный 0.196Поливиниловый спирт 7.01740414 9,0-11.01 1,0-13,0 9,0-1 1,0 0,192-0,1964,0-6,0Остальное 50 55 Дистиллированная вода ОстальноеРезультаты испытаний неодинаковы спримерами 1-3, Штамм ЕптегоЬас 1 егсоасаеАпри посеве 100 млн.мик,клеток/млдал ложноотрицательный результат(табл,1), 5П р и м е р 6, Способ использованиясистемы микротестов,Для постановки реакции Фогес-Проскауэра предварительно готовят суспензии испытуемых микроорганизмов в 10дистиллированной воде (1-2 колонии на 2 млводы) и в лунки каждого горизонтальногоряда полистиролового планшета вносят одну из приготовленных суспензий по 0,1 мл вкаждую лунку. Затем осуществляют инкубацию посевов при 37. 1 С, Учет результатовпроизводят через 18-24 ч, При этом полученный фиолетовый цвет среды в лунке расценивают как положительный, желтый - какотрицательный, 20Данные по чувствительности среды иточности дифференцирования в реакцииФогес-П роскауэра и ри веден ы в табл,1.Из табл.1 видно, что чувствительностьпредлагаемой среды в 4 раза выше. чем у 25прототипа (и римеры 1-3),Уменьшение количества глюкозы и аминопептида (пример 4) в составе среды нецелесообразно, так как ведет к искажениюрезультатов (ложноположительные реакции,Увеличение количества глюкозы и аминопептида (пример 5) ведет к ложноотрицательным результатам.Таким образом, оптимальный вариант 10, рабочей среды находится в пределах, г/л:Аминопептид 9,0-11,0Глюкоза 11,0-13,0Калий фосфорнокислый однозамещенныйБромкрезоловыйпурпурный 0,192-0,196. Поливиниловый спирт 4,0-6,0Дистиллированная вода ОстальноеВ подтверждение точности дифференциации предлагаемой среды были исследованы 50 выделенных штаммов энтеробактерий,Результаты исследований сведены в табл.2.Данные табл,2 свидетельствуют, что точность дифференциации энтеробактерий по реакции Фогес-Проскауэра на предлагаемой среде составляет 96;4, тогда как на среде по прототипу 76 ф ,Предлагаемая среда по сравнению с известной обеспечивает следующие преимущества: повышает чувствительность реакции Фогес-Проскауэра в 4 раза, а точность дифференциации энтеробактерий - на 22, упрощает проведение реакции (исключает добавление реактивов для выявления реакции), облегчает учет результатов вследствие большой контрастности цветов (фиолетовый - желтый),Кроме того, среда удобна в употреблении, что дает возможность использовать во всех бактериологических лабораториях здравоохранения, ветеринарии и других отраслях народного хозяйства.Формула изобретения Питательная среда для реакции ФогесПроскауэра, содержащая источник азота, глюкозу, калий фосфорнокислый однозамещенный, индикатор и дистиллированную воду, о т л и ч а ю,ц а я с я тем, что, с целью повышения чувствительности среды и упрощения проведения реакции, она дополнительно содержит поливиниловый спирт, в качестве индикатора - бромкрезоловый пурпурный, а в качестве источника азота - аминопептид при следующем соотношении компонентов, г/л: АминопептидГлюкозаКалий фосфорно-кислый однозамещенный Бромкрезоловый пурпурныйПоливиниловый спирт Дистиллированная водаХ Е Ю СГ 1 Е Х С Е с СР О С 1- О 1- О а С: 1 1 Х С СО Х С Е Ш СЧ От Ст О СОхЖ й0 С бл 1 л 9СО) О Й ОаРч Ю М Ю СЬОСОа Сл9 1 СОтб чО ОО лОт 4: ОО 1 0 Ь илИО 9Я (б09а О б цл9О8 О(ЬЭ От 1Ст О Рчал 910 1740414 таблица 2 Результаты реакции Фогес-Проскауэра Выделенные щтаммы ПрототипПредлагаемаясреда Данные поБердн;и К 1 еЬз 1 е 11 а рпецнопга 11 11 1 1 ВоЕп 1 а аве 1111111Епсе 3 гоьасгег с 1 оасае111111ЕпгегоЬассег аеговепев Ргосецз чц 1 Еаг 1 в11111111Ггогеца п 1 гаь 111 а1111Ба 1 вопе 11 а111311 1 Ба 1 апе 1 иЯЬ 1 е 11 а 3111111СЕГгоЬасег Егепй 111СЕггоЬасгег 1 ыегзцв31Е. со 1 г11111113 3 фР - разлиные реакции у разных штаммов вида ЕпегоЬассег 1 ас 1 ае. Составитель Л.Чичкина Редактор ТЛазоренко Текред М.Моргентал Корректор О, ЦиплеПроизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгородл.Гагарина, 101 Заказ 2050 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5