Способ получения фосфолипазы

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК А а) С 12 М 9 ГОСУДАРСТ 8 ЕН 00 ДЕЛАМ ИЗ КОМИТЕТ СССР РЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙс МЛНОТИь ОБРЕТЕНИЯ ЬСТВУ ТОРСНОМУ СВМДА(72) З.С.Евтушенко и С.Н.Лукьянова (71) Институт биологии моря Дальневосточного научного центра АН СССР (53) 577. 15(088.8)(56) 1, Зсапде 11 а С,1., КогпЬцд А. "А шешЬгапе - Ьоцпд рЬозрЬо 1 дразе А 1 рцгаИед Ггош Е. со 1 д, "ВхосЬешзггу, 1971, ч. 10, В 24, 4447-4456.2. Уап реп ВазЬ Н Аагзшап А.Р., чап Эсепеп Ь.Ь. И., Хзо 1 асоп апй ргорегйхез ой а рЬозрЬо 11 разе А асг.Ььгу агою ЬееГ рапегеаз", В 1 осМш. ВдорЬуз. Асса, 1974, 348, 197- 209. б по п.тем, чтопроводзе и кар ч т илцеллюОПИСАНИЕ И(54) (52) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФОЛИПАЗЫ А, включающий гомогенизирование животной ткани, зкстрацию, подкисление экстракта до рН 5,0, осаждение целевого продукта сульфатом аммония и хроматографическую очистку,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью получения продукта, свобод",ного от примесей лизофосфолипазы,в качестве животной ткани используюткишечник ОгесЦв цпыпсСцз, а экстракт перед подкислением подвергаюттермообработке при 45-55 С в течение5-10 мин, .2. Спосо 1 отлиаю-щий ся хроматографическую очистку я на диэтиламиноэ тилцеллюло боксиметлозе,1 11055Изобретение относится к способамвыделения биологически активных соединений из природных источников, аименно к способам получения липолитического фермента-фосфолипазы А 1(фосфатид-ацилгидролазы КФ 3. 1, 1.4) .Известен способ получения фосфолипазы А ЕсеЬексМа со 1 х 11.Однако при этом очищенный фермент наряду с фосфолипазной активностью обладает высокой лизофосфолипазной активностью.Наиболее близким к предлагаемомупо технической сущности и достигаемому положительному эффекту являетсяспособ получения фосфолипазы А 4, включающий гомогенизированйе животнойткани (поджелудочной, железы быка),подкисление экстракта до рН 5,0,осаждение целевого продукта сульфатом аммония и хроматографическуюочистку обычно на карбоксиметилцеллюлозе 2,Недостатками известного способаявляются загрязнениецелевого.продукта лизофосфолнпазой а также миогостадийность и длительность процесса выделения.Целью изобретения является полу"чение продукта, свободного от примесей лизофосфолипазы.Поставленная цель достигается тем,что согласно способу получения фос"Фолипазы А 1включающему гомогени,зирование жйвотной ткани, экстракцию,:подкисление экстракта до рН 1,0, осаж-дение целевого продукта сульфатомаммония и хроматографическую очистку,в качестве животной ткани используют кишечник НкесЬ 3.е цтйсхпсСце, аэкстракт перед подкислением подвергают термообработке при 45-55 С в те"чение 5-10 мин.Предпочтительно хроматографичес"кую очистку проводят на диэтиламиноэтилцеллюлозе и карбоксиметилцеллю-, 45лозе.В качестве животной ткани исполь"зуется кишечник ПкесМе цпс 1 пссце,встречающийся в морях Дальнего.Востока и являющийся доступным сырьем, 50Благодаря использованию термообработки гомогената достигается инактива-ция протеиназ, выпадение в осадокбйлластвых белков и повышение удельной активности целевого продукта. 55Нагревание необходимо проводитьопри температуре 45-55 С в течение5-10 мин,02 3 При более низкой температуре не все балластные белки выпадают в оса. док, а повышение температуры приводит к инактивацни фермента. Это же относится и к интервалу времени.П р и м е р. Для получения Фосфолипазы А предлагаемым способом берут кишечник от трех животных (100 г), гомогенизируют в трех. объемах 0,05 М трюс -НС 1 буфера и центрифугируют при 16000 в течение 30 мин, осадок отбрасывают, супернатант прогревают при 50 С 5 мин оставляют в холодильнике на несколько часов и центрифугируют при 16000 30 мин. Осадок отбрасывают, супернатант при энергичном помешивании доводят 4 Н НС 2 до рН 5,0 оставляют на 2 ч в холодильнике и центрифугируют. рН супернанта доводят кристаллическим оксиметил-аминометаном (Трис ) до рН 7,5. К супернатанту добавляют твердого сульфата аммония до 0,4 насыщения и оставляют на ночь в холодильнике, После центрифугирования осадокрастворяют в 5 мл 0,05 М трис -НС буфера рН 7,5. После дидлиза растворФермента наносят на колонку ДЕАЕ-целлюлозой. Размеры колонки: длина 15 см,диаметр 2,5 см, элюция сначала 0,05 М,йс-НСЙ буфером, затем ступенчатымградиентом 0,03 М НаС 1 в том же буфере, скорость элюции Зб мл/ч, объемсобираемых фракций 5 мл. ОпределениеФосфолипазной активности проведеноинкубацией субстрата 14 С-фосфатидил 3 холина с исследуемым Ферментным препаратом непосредственно на тонкослойной пластине с 810 над влажной камерой в течение 30 мин, последующим высушиванием пластинки при 70 Со в течение 5 мин, разделением хроматограммы в системе хлороформ-метанол- -аммиак (65-35-5) и обнаружением продуктов реакции парами иода. Количественное определение активности проводят, замеряя 14 С-активность продуктов реакции на спектрометре ЯцсекСесЬпщце 81,-30. Белковые фракции с максимальной фосфолипазной активностью объединяют и отдиадизовывают против 0,02 Мацетатного буфера рН 5,6. Белок в диализате концентрируют добавкойсухого акрилекса Рс последующимотделением набухшего акрилекса центрифугированием при 3000 в течение10 мин. Раствор 48 мг фермента в1105502 Таблица Схема очистки фосфолипазы А 1 из кнаечника ОгесМв цпьсдпсйцв% Общийбелок,мг Сдатия очистки ельне тивно и, ФХ белка 5016 2608,0 0,52 Исходный гомогенат о Прогревание при 50%,ФХ - фосфатидилхолин 5 мл 0,02 М ацетатного буфера рН 5,6 загружают на колонку КИ-целлюлозы (длина 10 см, диаметр 2,5 см, скорость элюции 30 ил/ч, элюция 0,02 М ацетатным буфером рН 5,6, затем ступенчатым градиентом 0-6,3 М НаС 1 в том ке буферф Активный пик фермента собирают и концентрируют акрилексом как описано вьве. Все процедуры10 но очистке фермента на колонках проводят нри температуре:6 оС.Использование предлагаемого способа позволяет выделить фосфолипазу А 1, очищенную в 39 раэ по сравнению с исходным гомогенатом,и получить фермент, обладающий только фосфоПодкисление до рН 5,0Осаздение (НН)801ДЕАЕ-целлюлоза,1 пикДЕАЕ-целлюлоза 11 пикДЕАЕ-целлюлоз а 111 пикКМ-целлюлоза липаэной А 1 активностью без приМеснлиэофосфоляпазые Предлагаемы споефбобеспечивает ииактивацию протеаз,выпадение в осадок балластаах белкови повыаение удельной активности фосфолипазы А благодаря использованиюна первой стадии очистки нровувэания гомогената щж 50 С в тачаете5 мин. Применение нового вида сырья позволяет получать фосфолипазу А как биохимический препарат для научных целей при исследовании биологических мембран и в синтезе фосфолщпщов и их производных.1105502 Т аблица 2 Лизофосфолипазная активность препаратов при выделении фосфолипаэы А 1 Стадия очистки 81 81 Подкисление до рН 5,0 82 Осаждение (ЮН 4) 804 81 ДЕАЕ-целлюпоза 1 пикСоставитель В.МуронецТехред М.Гергель Корректор А.Ференц Редактор Л.Повхан Заказ 5544/19 Тирек 522 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж"35, Раушская наб., д, 4/5. Исходный гомогенат Прогревание при 5 О С Определение с 2-ацилизо ФХф,7 гидролиза