Способ получения ферментных препаратов

) (1 11 А 61 К 37/4 ПИСАН О ЕНИЯ АВТО У СВ ЬСТВУ онов Вахт-исследоваой промыщленн(56) 1 .У 566872 А 1, отличто при хроматлидазы сорбциюионите КУ,2, а десор соб по п я тем, выделени яют на к Сп ра гъ ическ осуществ 100 М пр при рН 7 Н 4,7,3,цию ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Всесоюзный научительский институт мяности(53) 577.15 (088.8 )Авторское свидетельство СССР 5, кл. А 61 К 37/48, 1876.вторское свидетельство СССР В 1012, кл. А 61 К 35/48, 1956,3. Авторское свидетельство СССР У 827068, кл. А 6 К 37/48, 1978. ,Ц 4) (57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ из семенников убойных животных, включающий измельчение семенников, экстракцию и отделение жмыха с последующим выделением целевого продукта, о т л и ч а - ю щ и й с я тем, что, с целью более полного использования сырья и расширения ассортимента получаемых ферментных препаратов, а также интенсификации процесса, экстракцию проводят дистиллированной водой, из по- . .лученного экстракта выделяют фермент лидазу путем подкисления до рН 4,05 - 4,2 и термообработки при 40-43 С с последующим выделением фермента хроматографией на ионообменнике, а из жмыха, полученного после экстракции, выделяют фермент ронидазу.2, Способ по п.1 , о т л и ч аю щ и й с я тем, что выделение ронидазы из жмыха осуществляют повторныМ экстрагированием раствором уксусной кислоты при рН 4,8 - 5 с последующим отделением экстракта, его кон- с центрированием, стерильной фильтрацией и сушкой.25 Однако жмых, остающийся после экстракции семенников и содержащий, действующее начало препарата ронидаза, утилизируют, а не используют. Кроме того, указанный способ получения .лидазы длителеи (до 72 ч).Целью изобретения являются более полное использование сырья и рас.ширение ассортимента получаемых . ферментных препаратов, а также интен. .сификация процесса. Изобретение относится к производству лекарственных препаратов, применяемых в медицинской практике, и касается способа получения препаратов иэ животного сырья. 5Известен способ получения фермента лидазы из семенников крупного1рогатого скота путем автолиза ткани семенников, обработки лизата ацетоном, растворения осадка в воде и приготовления лекарственной формы препарата 1Известен также способ получения фермента ронидазы из семенников убойных животных путем экстракции сырья О,1 н. водным раствором уксусной кислоты при перемешивании, отделения экстракта от жмыха и последующего высушивания 2По известным способам получения ферментов лидазы и ронидазы в качестве исходного сырья берут семенники крупного рогатого скота, а остающийся после экстракции жмых, являющийся действующим началом препарата ронидаза, не используют, а утилизируют.Известен также способ получения лидазы иэ семенников убойных животных, включающий измельчение семенников, экстракцию уксусной кислотой, 30 отделение жмыха от экстракта с последующим вьделением лидазы из экстракта путем осаждения ацетоном, фиды рации, растворения осадка, вторичной фильтрации, переосаждения в ацетон, промывки и сушки ацетоном, растворе.ния и приготовления лекарственной формы препарата 3 Укаэанная цель, достигается тем,что согласно способу получения фер-ментных препаратов, из семенниковубойных животных, включающему измельчение семенников, экстракцию и отделение жмыха с последующим выделением целевого продукта, экстракциюпроводят дистиллированной водой, изполученного экстракта вьделяют фермент лидаэу путем подкисления до рН4,05 - 4,12 и термообработки при 4043 С с последующим выделением фермен;та хроматографией на ионообменнике,а из жмыха, полученного после экстракции, вьделяют фермент ронидазу.Вьделение ронидазы из жмыха осущеставляют повторным экстрагированиемраствором уксусной, кислоты при рН4,8-5,с последующим отделением экстракта, его концентрированием, стериль.ной фильтрацией и сушкой.При хроматографическом выделениилидаэы сорбцию обычно проводят накатионите КУ-100 М при рН 4,124,2, а десорбцию при рН 7,2-7,3.Способ позволяет одновременноизвлечь два фермента иэ одной порции сырья, решить проблему созданиябезотходной технологии, тем самыминтенсифицировав процесс эа счетрационального использования сырья,сокращения и упрощения процесса выделения лидазы - одного иэ получаемых продуктов, ускорить процесс вцелом,Технологическая схема предлагаемого способа получения ферментныхпрепаратов из семенников убойныхживотных может быть представлена вследующем виде;Семенники крупного и мелкого рогатого скота (замороженные при( -18 )- (-20 С)Измельчение на дробилкеИзмельчение на куттереЭкстракция (рН 6,8-7,2, жидкост"ный коэффициент 1:1, время 28-32мин при постоянном перемешивании,экстрагент-;дистиллированная вода)Отделение жмыха090407 Экстракт Концентрирование Сушка Подкисление экстракта уксуснойкислоты до рН 4,05 - 4,12 Прогрев .экстракта до 40-43 С нео более 25 мин при постоянном перемешиванииОхлаждение с последующим отделением осадкаСорбция осветленного экстракта на ионообменной смоле (рН 4,12-4,2) Отделение балластных веществ промывкой смолы ацетоном и ацетатным буферным растворомОтделение фермента лидазы промывкой подщелоченным раствором (рН 7,2- 7,3) дистиллированной воды Приготовление лекарственной формы препарата лидаза Длительность этого процесса 36 ч.П р и м е р 1. 00 кг заморожен-. ных семенников крупногои мелкого рогатого скота измельчают на дробилке (куски размером до 50 мм) и затем на куттере (размер частиц не более 1 мм )в холодильной камере при температуре не выше - 15 С, переносят сырье в реактор (емкостью 250 л, открытого типа, с рубашкой для подо-е грева, нижним спуском, мешалкой якорного типа со скоростью вращения 60-70 об/мин) , заливают 100 л дистиллированной воды, смесь прогревают40 и перемешивают для равномерного распределения частиц сырья в экстрагенте (5 - 1 О мин) , отмечают начало экстракции и регистрируют температуру смеси (0-2 С), через 28 иин выключают мешалку и подают смесь на45сепаратор типа "ЧезрЬа 1 еа" или Ы Ьача 1", после отделения жмыха экстракт переносят в емкость (на 250 л, открытого типа, с рубашкой для быстрого подогрева н охлаждения, с нижним спуском) , добавляют 800 млуксусной кислоты и подогреваютри постоянном перемешивании температуоУру доводят до 40 С не более 25 мин и сразу охлаждают до 8-10 С в течев ние 1,5-2 ч, а затем экстракт фильт" руют на воронках с бумажными фильтрами и подают на колонку, заполненЭкстракция (раствором уксусной кислоты рН 4,8-5,0, жидкостный коэффициент 1:0,3, время 2-2,5 ч)Отделение мезги Стериальная фильтрацияПриготбвление лекарственной формы препарата ронидаза ную смолой КУ-100 М в течение 1 ч, после чего колонку промывают 350 л ацетона (1,5 ч) и 40 л.ацетатного буфера (0,2 н. раствор) в течение 0,5 ч (водный раствор ацетона подают на регенерацию), а фермент лидазу отделяют промывкой смолы 50 л дистиллированной воды, подщелоченной водныи раствором аммиака до рН 7,2, в течение 1,5 ч, полученный раствор фермента (элюат) передают на стерильную фильтрацию, разливают во флаконы (количество раствора фермента во флаконе определяется после выявления спе.1 ифической активности элюата), осуществляют сублимационную сушку, укупоривают и маркируют флаконы. При этом на выход лидазы 310-320 флаконов из 1 кг сырья с активностью .64 усл.ед. в 1 флаконе. Оставшийся после экстракции лидазы жмых (количество 33-34 кг) переносят в реактор емкостью 150 л, открытого типа, с якорной мешалкой (120-130 об/иин) и нижним спуском, заливают 00 л раствора уксусной кислоты (450 мл СНСООН на 100 л воды), рН смеси при этом должно составлять 4,8 (корректировку рН производят уксусной кислотой или водным раствором аммиака) экстракцпо проводят при непрерывном перемешивании и 18-20 С, через 2 чосмесь сепарируют (сепаратор "ЧезЗаказ 2976/7 Тираж 688ВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Подписное ул. Проектная, 4 5рЬа 1 еа" или " Ос -Ьачо 1", а затем концентрируют в вакуум-выпа 11 ной установке (" 01 зо" или "Ьцча") до объема 10-11 л, подвергают стерильной фильтрации и сушке в сублимационной 5 установке. Количество порошка 520- 585 г с активностью не ниже 256 усл. ед. в 100 мг. Затем в активный порошок вносят тальк иэ расчета получения 32 усл.ед, в 00 мг,перемешивают в шаровой мельнице в течение 2-2,5 ч. Полученный порошок расфасовывают во флаконы из расчета по 5 г порошка в 1 флакон. Выход лекарственной формы 410-440 флаконов. 15П р и м е р 2. Берут 100 кг замороженных семенников крупного и мелкого рогатого скота, измельчение ведут так же, как в примере 1. Экстракцию проводят при 4 С в течение 20 32 мин, смесь сепарируют, к экстракту добавляют 850 мл уксусной кислоты и подогревают при постоянном перемешивании до 43 С (прогрев не болеео25 мин) , а затем охлаждают до 6 С 25 в течение 2,5 ч последующим отделением оСадка на воронках с бумажными фильтрами, Процессы сорбции и отделенг.- балластных веществ те же, что и в примере. 1.фремент лидазу отделяют Зо промывкой смолы 55 л дистиллированной воды, подщелоченной водным рас. твором аммиака до рН 7,3, десорбцию .проводят в течение 2 ч. Процессы фильтрации, сушки и приготовления лекарственной формы те же, что и в примере 1, При этом выход лидазы 31 5-330 флаконов из 1 кг сырья из расчета 64 усл.ед. вфлаконе. Технологические процессы полученияо ронидазы из жмыха те же, что и впримере . Выход лекарственной формы ронидазы 4,5-420 флаконов.П р и м е р 3. Берут 100 кг .замороженных семенников крупного и 1 оэлкого рогатого скота, иэмельчение ведут так же, как и в примере 1, Зкстракцию проводят при 3 С в тече- о Филиал ППП "Патент", г. Ужгород,яие 30 мин, смесь разделяют на сепараторе, добавляют к экстракту 825 млуксусной кислоты и прогревают пинепрерывном перемешивании до 42 Сне более 25 мнн, а затем охлаждаютв течение 2 ч до 8 С с последующим.оотделением осадка на воронках с бу-.мажными фильтрами, после чего проводят сорбцию и отделение балластныхвеществ по примеру 1, а десорбциюфермента лидаэы проводят 50 .л дистил.лированной воды, подщелоченной водным раствором аммиака до рН 7,25в течение 1,5 ч. Процессы фильтрации,сушки и приготовления лекарственнойформы те же, что и в примере 1. Приэтом выход лидазы 310-320. флаконови: 1 кг сырья с активностью 64 усл.ед. В качестве экстрагента для извлечения ронидазы из жмыха используютдистиллированную воду, подкисленнуюуксусной кислотой (420 мл уксуснойкислоты на 100 л воды) , рИ сиесипри этом .должно быть 5, экстракциюпроводят по примеру 1, а затем смесьпереносят на фильтрационные мешки(ткань В 2) и колируют в течение18 ч, остальные операции по примеру1. Приготовление лекарственной формыронидазы - по примеру 1. Выход ронидазы 400-415 флаконов.Из перерабатываемых отечественнойпромышленностью 25 т семенников крупного рогатого скота для производствалидазы по действующей технологииполучают 7 млн. флаконов лидазы вгод. По предлагаемой технологическойсхеме можно получить дополнительноиз 25 т семенников 1 млн. флаконовлидазы и 32 тыс. флаконов ронидазыв годе Причем трудовые затраты, стои-.мость реактивов и использование оборудования примерно такие же, каки при Производстве лидаэы по действующей технологии.Экономический эффект от внедренияпредлагаемого способа 78960 руб. вгод,