Способ получения двудольных растений, устойчивых к сульфонилмочевине

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК Й 2 9 й 15/84 5 ОСУДАРСТВЕН ЮЕ ПАТЕНТНОЕЕДОМСТВО СССРГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАК .ПАТЕНТУ ЗОБ Е ЕНИЯ 2 ч Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к получению фраг тении частично охарактеризованы и показывают некоторую степень ингибирования коментов нуклеиновых кислот, кодирующих нечного продукта, Неизвестно, состоят ли (р ацетолактатсинтазу,устойчивую кгербициду. энэимы АЛС.дроссей и растений из одного: . Сульфометуронметил и хлорсульфурон или более различных полипептидов. Данингибируют" рост некоторых .бактерий ные дают. основание предполагать, что месдрожжей и вывих растений путем ингиби- тоположение энзимов АЛС дрожжей и О рования,ацетолактатсинтазы (АЛС), первый растений находится соответственно в мито- а общий фермент в биосинтезе аминокислот хондриях и хлоропластах. Дь (валин, лейцин и изолейцин) с разветвленной Известно выделение генов, кодирую- цепью. Три основных ивофермента АЛС, щих енаимы АЛС иа кишечных бактерий : обоаначеннце 1, И и Ш. идентифицированы бамопеИа турп 1 тог 1 огп и Евсаег 1 со 1 а соп, а в кишечных бактериях. Изрферментыи И, также дрожжей Я,сегензае. Нуклеотидные но нв И, являются чувствительными к инги- последовательностигенов, кодирующих две бированию конечного продукта валином, субъединицы иэоэнзимов , И иАЛС Каждыйизтрехбактериальныхизоэнзимов .Е.со, показывают, что они организованы содержит большую и малую субъединицы как опероны ЬВч. чбМ и ИН соответстбелка. Энзимы АЛС из дрожжей Яасс)аго- венно. Сравнение. выведенных аминокисвусезсегечзаеи из некоторых высших рас- лотных .последовательностей больших,(71) Е.И,ДюпонДе Немур Энд Компанй (ОЯ) (72) Джон Роберт Бедбрук, Рой Скотт Чэлэфф,.Саверио Карл Фалько, Барбара Джин Мазур (ОЯ) и Нарендра Синг Ядав (й) -(56) С)аеИ Р.Я. и Рау Т.Р. НегЬсбе Реззтапй Мцтаптз 1 гов ТоЬассо .СеИ Совгез, Ясепсе .223, 1984, рр, 1148-1151,(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДВУДОЛЬНЫХ РАСТЕНИЙ, УСТОЙЧИВЫХ К СУЛЬФОНИЛМОЧЕВИНЕ(57) Использование: генетическая инженерия, в частности получение фрагментов нуклеиновых кислот, кодирующих ацетолактатсинтетазу, устойчивую к гербициду. Сущность изобретения: конструируют рекомбинантные плазмидные ДНК, кодирующие мутантную ацетолактатсинтетазу табака, трансформируют полученными ДНК клети Вгаззса, или .картофеля, или табака, или сахарной свеклы, или дыни, или хлопчатни.ка, или люцерны, отбирают трансформированные клетки, получают суспензионные каллусные культуры. проводят культивирование каллусной ткани и получают регенеранты, устойчивые к гербициду. 14 табл,(3) идентифицируют те фаги или плазмиды, которые содержат фрагмент ДНК, коди. рующий АЛС;(5) субклонируют фрагмент ДНК, несущий ген АЛС, в клонирующий.носитель, который способен произвести однонитевую ДНК;.(6) синтезируют олигонуклеотид длиной .около 15 - 20 нуклеотидов, который комплементарен определенной нуклеотидной по:следовательности АЛС, кодирующей одну из аминокислотных субпоследовательностей, за исключением нуклеотидного (-ных) изменения (изменений), необходимого для мутации;. (7) присоединяют олигонуклеотид к однонитевой ДНК,.содержащей мутируемый участок, и используя его для первичного синтезаи ч 1 тго нити комплементарной ДН К, образующей гетеродуплекс;(8) трансформируют бактериальные клетки гетеродуплексной ДН К;(9)осуществляют скрининг трансформированных бактериальных клеток для тех клеток, которые содержат мутированный . фрагмент ДНК, путем а) иммобилизации. ДНК на нитроцеллюлозном фильтозе, б) гибридизации с 5 -концом, меченам Р, мута 2 генным олигонуклеотидом и ри температуре окружающей среды и в) промывки ее в усло-. виях повышенной температуры с тем, чтобы избирательно отделить зонд от гена дикого типа, но не мутантного гена; .(10) выделяют фрагмент двунитевой ДНК, содержащей мутацию из клеток, йесу.щих мутантный ген; и(11) подтверждают присутствие мутации анализом последовательностей ДНК,Получение гербицидустойчивых растений;Фрагменты нуклеиновых кислот настоящего изобретения могут быть использованы для введения гербицидной устойчивости в растения. С целью вставления фрагмента нуклеиновых кислот, который включает ген, кодирующий гербицидустойчивую АЛС, в различные растения, используют .большое разнообразие методик в зависимости от желаемого вида или культурного сорта. Вообще эксплантц или протопласты могут быть . взяты или получены иэ растений, выращенных либои чего, либо в почве. Экспланты илИ протопласты могут быть получены из семядолей, стеблей, черевков, листьев, корней, незрелых зародышей, гипокотилий,.соцветйй.и т.д. В теории любая ткань, которой можно манипулировать 1 п чйго с образованием нового каллюса или55 на млрд, в трансформированнцх каллюсахтабака.. В работе, которая продолжается, фрагменты ДНК, содержащие сайтнаправленные мутации в гене ЗОВА, который, как ожидают, кодирует гербицидустойчивую организованного роста ткани, может быть использована для генетической трансформации.Для достижения трансформации экс плантаты или протопластц могут совместнокультивироваться с АдгоЬассегив, которую индуцируют для переноса фрагментов нуклеиновых кислот, расположенных между границами Т-ДНК плазмиды Т 1, в раститель ные клетки. Другой. способ, менее встречающийся на практике, заключается в прямом поглощении ДНК растительными протопластами.В примерах целый ряд эксплантов иэ, 15 различных растений культивируют совмест. но с АцгоЬас 1 егов с тем, чтобы достигнутьтрансформации в гербицидную устойчивость. Эти экспланты культивируют так, чтобы позволить расти.каллюсу. Затем каллюс 20 сразу исследуют на устойчивость к сульфонилмочевинам или растения регенерируют, а затем исследуют на устойчивость к сульфо.нилмочевинам, Исследование заключаетсяв ферментативном анализе экстрактов рас тительных клеток на наличие активностиАЛС, устойчивой к гербициду, и/или в выращивании растительных клеток в культуре Или целых растений в присутствии обычно ингибирующих концентраций гербицида.30 Фрагменты ДНК состоят из участка, кодирующего синтез гербицидустойчивой . АЛС, и участка, предназначенного для экс, прессии кодирующей последовательностив . растениях. Фрагмент ДНК(8,3 кб), кодирую щий белок гербицидустойчивой АЛС, состоитиэ приблизительно 800.п.н. в направлении 5 -конца (по направлению вверх) кодирующего участка, достаточного для экспрессии белка -в растениях. Этот фрагмент ДНК может при давать устойчивость к хлорсульфурону приконцентрации последнего до 2000 частей на млрд, в трансформированных калюсах табака, Растения, регенерированные из трансформированных клеток, также проявляют 45 устойчивость на уровне целого растения,Фрагмент ДНКдлиной 6,3 кб, который кодирует белок гербицидустойчивой АЛС, содержит 2,5 кб в.направлении 5 "конца (по направлению вверх) и 1,8 кб в направлении 50 3 -конца (по направлению вниз) кодирующего участка, достаточного для экспрессии белка в растениях. Этот фрагмент ДНК может придавать устойчивость к хлорсульфурону при концентрации последнего 2 частейАЛС, были выполнены заявителем. Эти мутации приводят к получению следущих аминокислотных замещений: Аа 122 на Зег, который как известно, операбелен в изознзиме И АЛС Е.соИ и дрожжевой АЛС, Аа 122 на Ча 1, который, как иэвестйо, операбелен в изоэнзиме И АЛС Е,со 1 и дрожжевой АЛС, Аа 122 на Рго, который, как известно, операбелен в дрожжевой АЛС, Рго 197 на Зег, который, как известно, операбелен в дрожжевой АЛС и в изаэнэиме И АЛС Е,соП, Рго 197 на А 1 а, который, как известно, операбелен в АЛС, кодируемой геном ЗОВВ-Нга табака, 1.уз 256 на 61 о, который, как известно, операбелен в дрожжевой АЛС, Азр 384 на Ча 1, который, как известно, операбелен в дрожжевой АЛ С, и Тгр 591 на 1 ео, которцй, как известно, аперабелен в дрожжевой АЛС и АЛС, кодируемой геном ЗОВВ-Нйа таба ка. Путем обьединения вышеприведенных мутаций также были выполнены двойные мутации, приводящие к получению двух аминокислотнцх замещенйй, таких как А 1 а 122 на Зег и Рго 197 на Зег, или А 1 а 122 на Зег и Рго 197 на А 1 а, или Рго 197 на А 1 а и Тгр .591 на 1.ео, или Рго 197 на Зег и Тгр 591 на 1 ео. Эти мутации были выполнены во фрагменте ДНК, содержащем примерно только 180 п.н, в направлении 5 -конца(па направлению вверх и только около 600 п,н. в направлении 3 -конца (по направлению вниз) последовательности, кодирующей АЛС. Эти фрагменты ДНК были вставлены в табак посредством трансформации. Гербицидная устойчивость не была экспрессирована в этих трансформантах, Полагают, что использование регуляторных последовательностей, найденных достаточными для экспресии гербицидной устойчивости с участкам, кодирующим мутант ЗОВА - СЗ, а именно 2,5 кб в направлении 5 -конца (па направлениювверх) и 1,8 кб в направлении 3 -конца (по1направлению вниз) кодирующего участка, привело бы к экспрессии гербицидной устойчивости со всеми сэйтнаправленнцми мутациями в участке, кодирующем ЗОВА.Сайтнаправленные мутации, которые, кэк ожидают, кодируют гербицидустайчивую АЛС, были выполнены также в гене АДС свеклы сахарной. Эти мутации приводят к получению следующих аминокислотнцх замещений: А 1 а 122 на Рго, который, как известно, операбелен в дрожжевой АЛС, Р го 197 на А 1 а, который, как известно, операбелен в АЛС, кодируемай геном ЗОВВ - Нга табака, Тгр 591 на 1.еокоторый, как известно, операбелен в дрожжевой АЛС и в АЛС, кодируемой геном ЗОВВ-Нга табака и двойного мутанта, Рга 197 на А 1 э и Тгр 591 нэ 1 ео.парирования, полиэтиленгликоля или дру 25 гих агентов или способов, известных для 30 35 40 50 5 10 15 20 который, как известно, оперэбелен в АЛС, кадируемой геном ЗОВВ - Нга табака,Предпочтительный способ встраивания фрагмента нуклеиновых кислот в растительные клетки заключается в использовании АцгоЬастегов тоае 1 асепз, содержащей фрагмент нуклеиновых кислот между границами Т-ДНК либо на бесплечевой плэзмиде Т(т.е, плазмиде Т 1, из которой удалены гены для иммуногенности апухолевых клеток). либо в бинарном векторе 1 п тгапз в плаэмиду Т 1 с Ч 1 г-функциями. АцгоЬастегов можно . использовать для трансформации растений инокулированием тканевых эксплантатов, таких как стебли или листовые пластины. или совместным культивированием с растительными протопластами. Другой предпочтительный способ встраивания фрагмента нуклеиновых кислот настоящего изобретения заключается в непосредственном введении фрагмента или вектора. содержащего фрагмент, в растительные пратапласты или клетки с помощью или без помощи электроизменения пропускающей способности мембраны к макромолекулам. Фрагменты нуклеиновых кислот настоящега изобретения можно использовать для трансформации протоплэстов или клеточных культур из широкого спектаа видов высших растений для образования культур растительных тканей настоящего изобретения. Эти виды включэютдвухдальные растения табак, петунья, хлопчатник, свекла сахарная. картофель, томат, салат-латук, дыня, подсолнечник, сая культурная, сапаа(рэпс) и другие виды Вгаззса и тополя; и однадольные растения (кукуруза, пшеница, рис, 1 аот ао 1 Лагоа и Азрагэцоз оИспэз). Ожидается, что все линии растительных клеток, имеющие протопластное происхождение, могут стабильна трансформироваться фрагментами настоящего изобретения.фрагменты нуклеиновых кислот настоящега изобретения можно также вставлять в растительные клетки с последующим образаванием трансформированных растений настоящего изобретения. Трансформация целых растений осуществляется в. растениях, клетки котарь х могут быть трансфармированы инородными генами на стадии, на которой могут быть регенерированы целые растения. В соответствии с настоящим изобретением трансфармируемые растения являются однодольными и двудольными растениями. Предпочтительно, если трансформируемые растения выбирают из труппы, состоящей из табака, петуньи, 1820914 24хлопчатника. свеклы сахарной, картофеля, томата, салата-латука, подсолнечника,. сои культурной, сапоа и других видов Вгаззса, тополей, люцерны, клевера, сахарного тростника, ячменя, овса и проса. Наиболее предпочтительно, если трансформируемые растения выбирают из группы, состоящей иэ табака, летуньи, картофеля, томата, подсолнечника, свеклы сахарной, люцерны, салата-латука или видов Вгаззса.Можно дополнительно повысить уровень экспрессии фрагментов нуклеиновых кислот путем замещения их первоначальных регуляторных нуклеотидных последовательностей и 5 - и 3 -концовАЛС-кодирующей последовательности синтетическими или природными последовательностями, обеспечивающими экспрессию высокого уровня и/или тканьспецифичную экспрессию, Можно также заместить нуклеотидные последовательности фрагментов нуклеиновых кислот настоящего изобретения другими синтетическими или природными последовательностями, которые кодируют транзитные пептиды, способствующие эффективному хлоропластному поглощению фрагментов нуклеиновых кислот настоящегб изобретения.Способ иллюстрируется следующими примерами,П. р и м е, р 1. Выделяют ДНК табака (Йсотапа тэЬасов сорта ХамЫ) иэ мутанта НЧа. Отщепляют листы 2 х 13 г размером .2,54-5,08 см (1-2 дюйма) от растений и сразу же разминают в 2 объемах па 20 мл буфе ра.А (10 мМ трицин-КОН, рН 7,6-1;14 М сахарозы - 5 мМ МцС 2 - 5 мМ 2-меркаптоэтанол) в холодной комнате с помощью ступок и пестиков. Прибавляют добавочное количество 40-50 мл буфера А, полученные суспензии фильтруют через 16 слоев марли. Фильтрат центрифугируют в роторе типа алоиз 65 А при скорости вращения 2500 об/мин и температуре 4 С в течение 5 мин, Осадок после центрифугирования ресуспендируют в 10 мл буфера А, примешивают еще 100 мл буфера А и клетки центрифугируют при указанных условиях. Полученные гранулы затем ресуспендируют в 100 мл буфера А в смеси с.0,4-ным раствором Тритона Х, выдерживают на льду в течение 10 мин и центрифугируют указанным обра. зом, Гранулы после центрифугирования дважды промывают в последнем буферном растворе, Полученные конечные гранулы ресуспендируют в 5 мл ресуспензионного буфера (50 мМ трис-НС, рН 8, 20 мМ ЭДТК), прибавляют 1 мл ресуспензионного буфера, содержащего 107 ь саркозила, а затем обьем доводят до 10 мл посредством ресуспенэи онного буфера. Прибавляют протеиназу К до концентрации 100 мкг/мл до получения лизатов, лизаты подвергают перевариванию при 37 С в течение ночи. Лизаты затем доводят до плотности 1,55 г/мл СзС и до конечной концентрации 300 мкгlмл бромида этидиуса, Растворы центрифугируют в роторе типа Весцпап Т 70,1 при скорости вращения 40 000 об/мин при 15 С в течение 24 ч, полосу флуоресцентной ДНК снимают после визуализации длинноволновым УФ- излучением. Для снятия ДНК в боковых стенах трубок полиалломера прокалывают отверстия иглой калибра 18, что дает воз 10 можность вязкой ДНК капать каплями в трубку для сбора материала. Для предотвращения среза ДНК на всех стадиях после. лизисэ клеток соблюдают большую осторожность. ДНК вновь ресуспендируют в 15 20 мягких условиях в растворе СзС с плотностью 1,55 г/мл и бромида этидиума с концентрацией 300 мкг/мл, а затем центрифугируют в.ротора типа Загча ТГТ 65,13 при скорости вращения 40, 000 об/мин и при 15 С в течение 48 ч. Затем ДИК вновь собирают через боковой прокол трубки-сборника. Затем ее экстрагируют 10 раз в мягких условиях посредством изоэмилового спирта, насыщенного ТЕ-буфером(10 мМ трис-НС, рН 8, 1 мМ ЭДТК), а затем экстенсивно диализуют против ТЕ-буфера.Конструируют библиотеку ДНК табака. ДНК табака гидролизуют рестрикционным энэимом Бао ЗА с образованием большин 30 35 ства фрагментов, как определено электрофорезом в агарозном геле, протяженностью в интервалое 20 кб, (т,п,о). Полученные фрагменты нагружают на градиенты 10-40 сахарозы (в 1 М МаС 1, 20 мМ трис, рН 8, 1 мМ рифугированием в роторе типа ВеЬпап ИЧ 28 при скорости вращения 26000 об/мин и при 17 С в течение 16 ч, Фракции, образованные.от градиентов.концентрации сахарозы, собирают и анализируют электрафореэом в агарозном.геле, причем фракции, содержащие фрагментй размером 20 кб (20 т,п.о.), диализируют против ТЕ-буфера и осаждают этанолом. Затем указанные фракции лигируют с плечами ЕМВ.3 фага лямбда, расщепленными ВавНпри молярном соотношении 2;1, и упаковывают в головки фага лямбда, следуя инструкциям изготовителя по плечам генома лямбдв и реакциям 50 55 упаковки Библиотеку ДНК табака, содержащую 400 000 фагов, высевают в чашки со штаммом-хозяином Е,соЕ 392 при плотности 50 000 фагов на 150 мм чашку Петри с распределением на 10 чашках. Осуществляют 40 ЭДТК)и фракционируют по размерам цент10 вставку, отличающуюся от укаэанной, которая, как предполагают, содержит ген ЯОЯВНга, кодирующий АЛС, устойчивую к 30 35 40 50 перенос из бляшек фага на сдвоенные нитроцеллюлозные фильтры и затем гибуидизируют с зондами, меченными Р из несущими либо 5 - ,либо 3 -фрагменты гена1АЛС, полученные в системе мечения рибозондов, Бляшки, дающие положительные сигналы на пленках.иэ .обоих комплектов фильтров, собирают и очистку повторяют многократно до тех пор, пока не получат хорошо изолированные гибридизирующиеся бляшки,Анализируют минипродукты ДНК из очищенного фага обработкой рестрикционным энзимом. Различаэт два класса вставок фрагментов клонированной ДНК табака, Фаги 1, 2, 17 и 18 содержат вставки, родственные с ранее выделенным геном АЛС из места ЯОЯА, кодирующего чувствительную к гербициду АЛС, Фаг 3 содержит гербициду.Фрагменты ЕсоЯ (, которые окружают участки гибридизации фага 3, субклонируют.в фаговые векторы М.13 и проводят анализ последовательности ДНК, используя олигонуклеотиды для расширения секвенированных участков в перекрывающихся сегментах, Обнаружена единственная открытая рамка считывания из 1992 нуклеотидов, которая идентифицирована как ген АЛС путем сравнения выведенной аминокислотной последовательности с консервативными участками аминокислотных последовательностей белков АЛС других видов,АЛС-гены, изолированные из гербицидустойчивого мутантного табака Нга, вводят в чувствительные клетки табака через систему "бинарный вектор", используя АдгоЬастег(цгл 1 цее 1 ас(епз. гены АЛС первоначально вводят в бинарный вектор в Алц(пеГас(епз через коньюгацию плаэмиды и затем используют сконструированную Алц(пегас(епз для трансформации растительных клеток чужеродными генами путем совместного культивирования.А). Введение изолированных генов АЛС табака в АлцгпеГас(епз 1). Очищенный фрагмент нуклеиновых кислот Яреразмером 8,3 кб настоящего изобретения, изолированный из мутанта НЧа табака и содержащий кодирующую последовательность для гербицидустойчивой формы гена АЛС, вставляют в сайт ХЬаплазмидного вектора рМцс 19. Хотя рестрикционные энзимы Яреи ХЬараспознают отличающиеся ДН К-последовательности, продукты этого гидролиза носят аналогичную, выступающую на 5 -конце последовательность. Ориентацию вставляемого фрагмента в одной из результирующих плазмид рА 6 Я 148 определяют за счет анализов с помощью рестрикционного энзима.Бинарный вектор рА 6 Я 135 используютдля переноса плазмиды рА 6 Я 148 в Алцае 1 ас(епз. Плазмида РА 68135 происходит из плаэмиды рА 6 Я 112. Она получена в результате переваривания ДНК плаэмиды рА 6 Я 112 рестрикционной эндонуклеаэой ХЬо (, обработки фрагментом Кленова полимераэыДНК Е,со( и самолигации ДН К, за счет чего осуществляется удаление сайта ХЬовне правого и редела Т - ДН К. Плазмида 5 рАОЯ 112 происходит от вектора р АЕЯ сшироким диапазоном хозяев. Она получена путем встраивания ее в р АЕЯ фрагмент ЕсоЯ 1, в котором пределы Т-ДНК ограничиваются геном для экспрессии устойчивости к канамицину в растениях и уникальным сайтом ВатНдля клонирования. Плазмиды рА 6 Я 148 и рА 6 Я 135, очищаемые СзС(, переваривают ВавНи образующиеся ВаглН- расщепленные плазмиды связыва ют. Гибридную ДНК вводят в фаг лямбда (ич(тго и используют для заражения штамма НВ 101 ЕзсЬег(сйа со(. Трансформанты выбирают на ампициллине.2). Коньюгация плаэмиды рА 6 Я 152 изЕ,со( в Алцае 1 ас(епз,Плазмиду рА 6 Я 152 вставляют втцае 1 ас(епз путем конъюгации, Йтамм НВ 101 Е.со, содержащий плазмиду рА 6 Я 152; и штамм НВ 101 Е,со, содержащий мобилизирующий вектор рЯК 2013 (АТСС 37159), смешивают с штаммомВА 4404 Алцве 1 ас(епз, содержащим плазмиду рА( 4404, и подвергают скрещиванию на твердой ( В-среде при 28 С в течение 16 ч. Трансконьюгаты селектируют на пластинах, содержащих рифампицин при концентрации 100 мг/л и тетрациклин при 1 мл/л.Алцве 1 ас(епзВА 4404: рА 6 Я 152 подвергают рестрикции на минимальной А-среде, содержащей тетрациклин при 1 мг/л.В основном аналогичный метод используют для .получения как штамма ША 4404 Алц(т е 1 ас(епз, содержащего плазмиду рА 6 Я 112, причем бинаирный вектор не содержит какой-либо вставки фрагмента нуклеиновых кислот, так и штамма ( ВА 4404 Алцгпе 1 ас(епз, содержащего плазмиду рА 6 Я 145, причем бинарный вектор содержит фрагмент нуклеиновых кислот от фагового клона 1, Последний фрагмент также изолируют иэ мутанта Нга растений табака и он несет ген для экспрессии гербицидчувствительной формы АЛС, этот ген не является аллелем дикого типа гена для экспрессии гербицидчувствительной АЛС. а представ 1820914ляет собой ген ЯОВА иэ второго генетического лркуса,В). Введение изрлиррванных генов АЛСв чувствительные клетки табака посредством совместного культивирования клеток растений с штаммами .ВА 4404 Алцве 1 ас 1 епэ. Все манипуляции на стерильных средахи растительных материзлах пррврдят в колпаках с лэминарным потоком в приемлемыхемкостях. Выращивание растений и культивирование растительных клеток проводятпри 27 С. Все манипуляции на протрпластзх осуществляют при комнатной температуре, если не указано пр-другому.1 день (после полудня),Приготавливабт среду для изоляциипротрпластов путем прибавления следующих компонентов к КЗ/Я (1) - среде: 0,1(мас,/об.) МЕЯ-буфера (Ядва СЬев са 1 Со,),1 (мас./рб.) целлюлазы (Опрайа или целлюлизин) и 0,1 ф 6 мацеразы (ОпогцМа). Послерсторожнргр перемешивания примерно втечение 30 мин значение рН доводят д 5,6с помощью КОН и полученную среду стерилизуют на фильтрах.Стерильные растения табака (М 1 с 11 апатаЬасцщ сорта Висконсин) культивируютиз 1 см апикальных или вспомогательныхэксйлантатрв на ОМЯ-среде в коробках типаМагента при цикле из 16-часрвргр светлогопериода (6000-8000 люкс) с последующим8-часовым темным периодом. Когда растения дрстигнут 5-7 недельного возраста, ртщепляют полностью распустившиесялистья (3-6.листьев снизу от верхушки) икаждые двз листа помещают верхней поверхностью вниз на 20 мл среды для изоляциипрртоплэста, содержащейся в чашке Петриразмером 100 х 250 им. Затем листья погружают в среду и мелко измельчают острымхирургическим скальпелем. Среднюю жилкулиста фиксируют и надрезы делают наружурт нее в направлении к краю листа с промежутками примерн 2 мм. После этого чашкиПетри герметиэируют парапленкрй и маце, рированную ткань инкубируют в течение ночи (14-17 ч) в темноте при 27 - 29"С приосторожном встряхивании в роторе (20-25об/мин).2 день (утро).Воронку для фильтрования емкостью 75мл; заполненную 4 слоями марли, закрепляют в крпьцевидном держателе. Стекляннуюпробирку (длиной примерно 15 см и внешним диаметром5 мм прикрепляют к воронке с системой трубок из латекса.. Используемую воррнку. марлю, системутрубок и пробирок из стекла и латексэ эаво 50 Алцее 1 ас 1 епз измеряют при 550 нм, доводят д 0,15 с помощью среды "Минимал А" и бактерии продолжают выращивать, как указано выше,3 день(после полудняКогда оптическая плотность (при 550 нм) культур Алцее 1 ас 1 епз составляет 0,6 (логарифмическая фаза культур), примерно через 6 ч после разбавления указанные бактерии вносят в клетки при титре прймерно 50 бактерий/растительную клетку (оптическая плотность порядка 1 при 550 нм - 1,4 х х 10 бактерий), Полученную смесь бактерий9и растительных клеток совместно культивируют в течение 66 ч при 24 С при слабом рачивают в алюминиевую фольгу и стерилиэуют в автрклаве в виде единого целого.Систему стеклянных пробирок помещают в колбу Бабкрка, а марлю пропитывают 5 средой КЗ/Я(1), Переваренную ткань листас двух чашек Петри осторожно выливают в воронку. Марлю промывают и выжимают в указанную колбу, Заполненные колбы доверху заливают средой КЗ/Я(1), покрывают 10 фольгой и центрифугируют примерно при100 хв течение 10 мин. Плавающие протопласты (1-2 мл) собирают серрлогическрй пипеткой (1 мп) и помещают в 20 мл среды КЗ/Я(1), содержащейся в другой колбе Баб кока, После ресуспендирования протрпластов за счет осторожного перемешивания колбы Бабкрка заполняют доверху и центрифугируют, как указано ранее.,Плавающие протопласты (1 - 2 мл) собирают пр описан ному методу и помещают в 30 мл средыКЗ/6(1). Указанные прртопласты подсчитывают в гемацитрмере, а полученный объем регулируют для получения 1 х 10 прртопластов на мл. 5 мл аликвот прртрпластрв 25 высевают в чашки Петри (тканекультивируемые чашки Петри размером 100 х 20 мм (Сргп 1 пц) эти чашки используют вр всех последующих манипуляциях с прртопластами) и выращивают в темнотс.30 2 день (после полудня)Единую колонию клеток Алцае 1 зс 1 епэ,содержащую вектор трансформации требуемого растения, а именно рАОЯ 112(укаэанный плазмидный вектор), рАОЯ 152 (содержащий, 35 фрагмент нуклеиновых кислот настрящегоизрбретения) или рАОЯ 145 (содержащий нуклеиновую кислоту, крдирующую .чувствительную форму АЛС); выращиваемую на пластине "Минимал А", инокулируют в 5 мл среды 40 "Минимал А" в 18 мм тестируемой пробиркии выращивают в течение ночи в роликовом барабане при скорости вращения 40-60 рб/мин при 27-28 С.3 день (утро)Оптическую плотность культур55 освещении (примерно 500 люкс). Нетрансформированные протопласты-контроли инкубируют аналогичным образом, но без использования агробактерий. Для каждого совместного культивирования проводят последующее протоколирование (для клеток, трансформированных различными агробак- териями, а также для нетрансформированных клеток).6 день (утро)Совместное культивирование прерывают путем прибавления 20 мл смеси в соотношении 1:1, состоящей из среды КЗ/6(2) и среды С, дополненной 500 мг/л цефотаксима (при отборе против агробактерий) к 5 мл смеси для совместного культивирования. Совместно выращенные клетки осторожно и тщательно ресуспендируют в новой среде путем смешивания серологической пипеткой (5 или 10 мл). Плотность клеток составляет 2 х 10 протоппастных эквивалентов/мл (протопластные эквивалентные = исходным протопластам при 100 выхода и выживаемости клеток), а осмолярность составляет 0,35 М. Три порции по 5 мл аликвот из каждой культуры распределяют в свежих чашках Петри..С этого момента до тех пор, пока культивируемые клетки не внедряется в твердую среду. они растут при слабом освещении (500 - 1500 люкс) без движения и их переносят в различные среды в стерильных условиях. В указанные времена клетки из одной чашки переносят в неселективные среды, в то время как клетки с других двух чашек из каждой культуры переносят в селективные среды, содержащие либо 50 мг/л канамицина или 2 нг/мл хпорсупьфурона для отбора трансформированных растительных клеток, Для этих переносов клеток содержимое из каждой чашки собирают с помощью серологической пипетки (5 мл), помещают в раздельные конические трубки центрифуги из полистирола (емкостью 15 мл) и центрифугируют примерно при 50 х ц в течение 5 - 10 мин. Надосадочную жидкость удаляют пипет.кой, не разрушая рыхлых гранул, Полученные гранупы из совместно выращиваемых клеток с каждой из чашек затем осторожно ресуспендируют в соответствующей свежей среде.10 деньКлетки переносят в 5 мл среды С, которая в случае несепектируемых растительных клеток дополнена 500 мг/л цефотаксима. а в случае селектируемых клеток дополнена 500 мг/п цефотаксима и либо 50 мг/л канамицина, либо 2 нг/мл хлорсульфурона. Каждую из укаэанных культур возвращают в чашки Петри, из которых они были взяты. Таким образом, для осуществления обмена50 смеси в соотношении 1:3, состоящей из среды С и среды МЗР, дополненной 50 мг/л канамицина или 2 нг/мл хлорсульфурона, 5 мл аликвот+3 ресуспендированных культур(5 х 10протопластных .эквивалентов/мл) распределяют по четырем свежим чашкам Петри на селектируемую культуру и выращивают, как указано выше.23 - 24 дниКаждую культуру сепектируемых клетокобъемом 5 мл разбавляют 7;5 мл среды МЯРдополненной 50 мг/л канамицина ипи 2 нг/мп хлорсульфурона в целях получения в среде с минимальной потерей клеток, невсе клетки должны быть гранулированы,13 деньНеселектируемые клетки переносят в 205 мл смеси с соотношением 3:1. состоящей изсреды С и среды МИР с добавкой 500 мг/лцефотаксима, и 5 мл аликвоты распределяют в свежей чашке Петри (при плотности 5 хх 10 з протопластных эквивалентов/мл). Се 10 лектируемые клетки ресуспендируют в 5 млсмеси (3:1), состоящей из среды С и средыМЯР, дополненной 500 мг/л цефотаксима и50 мг/л канамицина, либо 2 нг/мл хпорсульфурона и возвращают на первоначальные15 чашки для последующего культивирования.16 - 17 деньКлетки переносят в 5 мл:меси в соотношении 1:1, состоящей из среды С и средыМЯР, дополненной 500 мг/л цефотаксима(в20 случае неселектируемых растительных клеток) ипи 500 мг/л цефотаксима и либо 50мг/л канамицина, либо 2 нг/мл хлорсульфурона (в случае селектируемых клеток) и выращивают, как описано выше,25 20 деньНеселектируемые клетки переносят в 25. мп смеси в соотношении 1:1, состоящей изсреди С и среды МЯР, и затем полученнуюсмесь прибавляют в 25 мл смеси в соотно 30 шении 1:1, состоящей из 2 объемов средыМИР и 1; (мас./об,) раствора агарозы типаЧП (температура 50 С). Полученную культуру быстро перемешивают серологическойпипеткой (25 мл) с широким отверстием и35 распределяют в 5 мл аликвот на свежие чашки Петри. Суспендированные микрокаллюсыв растворе агара осторожно и равномернораспределяют по чашкам взбалтываниемвручную. Чашки покрывают и оставляют под40 колпаком в течение часа для затвержденияперед тем, как их обернут в парапленку иперенесут в вегетационную камеру. Плотность клеток составляет примерно 5 х 10протоппастных эквивалентов/мл и осмолярность составляет 0,15 М. Внедрившиеся клетки подсчитывают примерно 10 дней спустясчетчиком для подсчета колоний. Селектируемые клетки переносят в 20 мл1820914 Среда для культивирования йлаЬасов плотности клеток 2 х 10 протопластных+зэквивалентов/мл. Эту культуру с установленной плотностью смешивают с 12,5 млсреды в соотношении 1;1, состоящей из 2обьемов среды МБР и 1 (мас./об.) раствора агарозы типа ЧИ (температура 50 С), дополненной 50 мг/л канамицина или 2 нг/млхлорсульфурона. 5 мл аликвот перемешанных культур быстро распределяют с помощью широкогорлой серологическойпипетки (25 мл) на свежие чашки Петри, Конечная плотность посева составляет 1 х 10зпротопластных эквивалентов/мл, а осмолярность культуры составляет 0,1 М. Чашки отверждают, как описано выше. Внедрившиесяклетки подсчитывают примерно 10 дней спустя счетчиком для подсчета колоний.25 деньОт 10 до 12 индивидуальных трансформированных каллюсов/колоний собирают ипереносят скальпелем М 11 в чашку Петри,содержащую среду МБР с использованиемили без использования соответствующегоселективного агента для регенерации растений. Каллюсы выращивают при 27 С с фотопериодом в 16 световых часов (5000 - 8000люкс) с последующими 8 ч темноты, Побегипоявляются спустя 2-3 недели и продолжают свое развитие в течение нескольких месяцев. Побеги длйной 2-3 йм срезаютострым хирургическим скальпелем и переносят для укоренения в среду ОМЗ в ящикиМагента. После образования корневой системы (1-4 недели) растения переносят в почву для регенерации,Результаты совместного культивирования.Полученные результаты вследствие экспериметов по совместному культивированиюпоказывают, что фрагмент нуклеиновых кисЪ К /Б (1) - сахароза, фитогормонный резжим 1 (повышенный)К /6 (1) - глюкоза. фитогормонный режим 1 (повышенный)К /6 (2) - глюкоза, фитогормонный режим 2 (пониженный) лот настоящего изобретения, кроме гена БОВА табака для экспрессии .гербицидчувствительной формы АЛС, придает устойчивость к гербициду, когда его вводят в гербицидчувствительные клетки табака (см. табл.4 и 5). Поскольку фрагмент нуклеиновых кислот настоящего изобретения может придать устойчивость к гербициду при аналогичной частоте, когда его вводят в любую ориентацию относительно вектора, он содержит регляторные последовательности обоих 5 - и 3 -концов относительно кодирующей 1последовательности, которая необходима для экспрессии гербицидустойчивого гена АЛС.Уровень устойчивости к гербициду, придаваемый фрагментом нуклеиновых кислот настоящего изобретения, определяют путем посева 100 колоний каждой из трансформированных клеток рА 6 Б 152 МлаЬасшп, устойчивых к хлорсульфурону при 2 ч. на млрд, и не совместно культивированных клеток дикого типа ЙлаЬасов при различных концентрациях хлорсульфурона. Подсчитывают количество активно растущих колоний при различйых концентрациях хлорсульфурона после 1 месяца (см,табл,6). В то время как колонии дикого типа чувствительны к хлорсульфурону при концентрации 2 ч. на млрд колонии, получаемые из совместного культивирования с плазмидой рАОБ 152 Алцае 1 ас 1 епз, могут выдержать концентрации до 2000 ч. на млрд. Такой уровень устойчивости полученных трансформан-. .тов сравним с уровнем гербицидустойчивого мутанта Нга табака, из которого фрагмент нуклеиновых кислот настоящего изобретения изолирован, причем он примерно в 10 раз выше уровня гербицидустойчивого мутанта Б 4 табака (родитель Нга). 1-йАА 3,0 мг/л 2 - ЙАА 0,1 мг/л ВАР 1,0 мг/л БАР 0,1 мг/лрН доводят до 5,7. стерилизуют на фильтре и хранят при 5 С.33 1820914 Среда МЯР для регенерКомпонент Загрузк стений 1 мгlмл 1 мгОмл Н доводят до 0,8 % (масс/о мгО 1 мгОмл в 5 мМ К.ОНРаспределяют 25 мл на чашку Петри (100 х селективные агенты в стерильных условия25 мм) и при необходимости прибавляют после охлаждения среды до 50"С,Конечная ол-во- 100 мл 10 мл-млСоли-макроэлементыГе ЗДТКВитамины В 5Микроэлементы МЯМикроэлементы МЯСахарозаМез - буферИААВАР АгарСмесь автоклавирую Сульфат канамицин илиХлорсульфурон 10 Х 100 Х 1 ООХ ОООХ ОООХ. Магента азме ом 7,62 см Х 10,16 см( КонечнаяКол-во/л Загрузка автоклав в 990 мл М 98047 Н 20 20Глюкоза Для отвеждения среды: агар (15 г/л)фирмы 011 со Васю автоклавируют в отдельном объеме 500 мл, Перед посевом соли иагар смешивают. тдо 3) ТК полностью растворяют перед прибавлением РеБО; значение рН Среда ОМВ (для поддержания растений)Компонент Микроэлементы МЗИВитамины В 5СахарозаМез - буферАгар К 2 НР 04КН 2 Р 0410,5 г 4,5 г 1,0 г 0,5 г 1 мл добавляют стерильно . 10 мл добавляют сте ильно(2-1 й-морфолино) зтансульфокислота)Агароза типа У с низкой температуройзастудневания ( удерживается в расплавленом состоянии при 50 С)Целлулизин"МацеразадЦефотаксим, натриевая соль,разбавлен м/г д. Н 20 стерильнаяхранят при 5 С в темноте менее10 суток в качестве основногораствора (50 мгмл)Сульфат канамицина,разбавлен м/г д. Н 20, стерилизированная на фильтре, хранят при-20 С, в темтоте, в качестве основногораствора (50 г/мл),Хлорсульфурон а 1 ЫосЬеваЫосЬещ .а 1 Ьосмаев 4 2 1 ста КаЫе Оагпоп /1 ЕС Ь 3 оп Нй - 3П р и м е р 2, Получают ДНК табака из мутанта СЗ и конструируют, как описано в примере 1, геномную библиотеку ДНК на бактериофаговом векторе ЕМВ 1.3. Фаг, несущий гены АЛС, идентифицируют, как описано в примере 1, посредством гибридизации с 5-концом зозн 2 да фрагмента гена АЛС табака. меченным Р.Шесть независимых рекомбинантных фагов изолируют путем скрининга из 600 000 рекомбинантов из библиотеки мутанта СЗ, Анализ рестрикционной зндонуклеазы этих изолированных фагов показывает, что ашки Петри для тканевои кулаэмером 100 мм х 20 ммолба БабкокаЦентрифуга ( приспосабливаеколбой Бабкока)щики Магента размером,63 см х 10.16 смгар Т.С,Ебо ропт де Йеаоигз апд Соврапу, М 1 а потоп Ое 1 аааге 19898епта Согр., 4149 О/.Моптго СЬса 9 о, И 68641 КС Воо 91 са СВДНК-встааки из 3 фагов могут быть линеарны с геном ЗОВА из библиотеки мутанта Нга (фаги 35,36 и 38). Остальные 3 фага (фаги 31, 34 и 37) содержат вставки ДН К, соответствующие гену ЗОВВ. Как полагают, ген АЛС в фагах 35, 36 и 38 является геном ЗОВА - СЗ, кодирующим гербицидустойчивую АЛС, а ген АЛС в фагэх 31. 34 и 37 является геном ЗОВВ, кодирующим гербицидчусствительную АЛС.Фрагменты ДНК из фагов 31, 35 и 38 субклонируют в плазмиду рОС 119, а затем в бинарный вектор плазмиды рА 6 З 135, в ос 1820914субьединиц иэоэнзимов АЛС Е.со 1 показывают три участка, содержащих приблизительно 50 консервативных аминокислот,на приблизительно 2/3 состоящих из бел,ков и разделенных участками с малоразличимой гомологией. Консервативные аминокиспотные последовательности встречаются также и среди малых субъединиц бактериальныхизоферментов, В дрожжах З,сегечз 1 ае бцлидентифицирован единственный ген 11 ч 2, 10кодирующий активность АЛС. Анализ нуклеотидной последовательности гена 11 ч 2выявил, что полипептид, кодируемый им,томологичен большим субъединицам бактериальных изоферментов АЛС. Аминокислотная 15последовательность АЛС дрожжей. характе. ризуется такой же структурной организациейи степенью гомолагии, которая наблюдаетсямежду большими субъединицами бактериальныхизоферментов, за исключением того, что около 20девяноста аминокислот в аминоконце дрожжевого белка обеспечивают перенос белка в митохондрию, Ранее не было никакой информацииотносительно структуры генов растений, кодирующих АЛС, или аминокислотной последовательности энзимов АЛС растений,Изофермет кишечных бактерий представляет собой единственную известнуюАЛС в природе, которая является нечувствительной к ингибированию сульфометуронметилом и хлорсульфуроном. Поэтомукишечные бактерии чувствительны к этим .гербицидам только в присутствии валина,который ингибирует изофермент 1, Идентифицированы сульфонилмочевинные гербицидустойчивые мутантные формы кишечныхбактерий Яаеопеа турЬеогце и Е.со(отобранные в присутствии валина), дрожжей З.сегеч 1 з 1 ае и высших растенийчсоОапа таЬасое. (таба,к), АгаЫсорз 3 40Фаапа и Ееа еауз (кукуруза) .Эти мутантные фенотипы совместно расщепляются кгербицидустойчивым формам АЛС посредством генетических кроссов, ВЗлурЫецгце гербицидустойчивые мутации связаны 45с геном, кодирующим АЛС, а в Е.со иЯ,сегечзае эти мутации заключены в структурных генах для АЛС. В высших растенияхмутации, ответственные за устойчивость,наследуются как единственные доминантные или полудоминантные ядерные призна. ки. В табаке эти мутации картируются поодному из двух несцепленных генетическихлокусов, Хотя многие гены; вовлеченные вструктуру и функцию дифференцированных 55растительных тканей иорганов, не экспрессируются в недифференцированных тка-нях, те, которые учасгвуют в основныхклеточных функциях, экспрессируются и могут быть отобраны в дезорганизированном каллюсе или культуре. клеточной суспензии. Это демонстрировалось во многих случаях путем отбора фенотипа в тканевой культуре, из которой были регенерированы растения, экспрессирующие такой же фенотип,Известен способ получения двудольных растений, устойчивых к сульфонилмочевине, предусматривающий получение суспензионных каллусных культур, отбор клеток, культивирование. каллуса и получение регенерантов, устойчивых к гербициду.Поскольку ацетолактатсинтетаза представляет собой энзим, вовлеченный в аминокислотный биосинтез, было продемонстрировано, что гены, кодируЮщие этот фермент, экспрессируются в каллюсовой ткани так же, как и в целом растении, Мутанты табака 4, СЗ и Нга. устойчивые к сульфонилмочевине и описанные в этом патенте, вначале были отобраны в тканевой культуре и затем регенерированы в целые растения, в которых устойчивые фенотипы были сохранены генетически стабильным образом. Каллюсные ткани, происходящие от регене-рированных растений или их потомства, продолжают расти при концентрациях гербицида, которые ингибируют рост каллюса дикого типа, Таким образом, устойчивость к гербициду на основе счльфонилмочевины на клеточном, уровне растений указывает на устойчивость на уровне целого растения,Существуют ограничения для получения гербицидустойчивых сельскохозяйственных растений посредством тканевой культуры или обработки семян мутагеном: 1) метод культуры тканей ограничен теми культурами растений, которые могут подвергаться манипулированию в тканевой культуре и регенерации из тканевой культуры, 2) растения, происходящие от обработанных мутагеном семян и может быть из тканевой культуры, могут иметь нежелательные фенотипы, которые потребуют отщепления многочисленных генетических обратных скрещиваний и 3) перенос устойчивого гена путем размножения был бы ограничен культурными сортами одних и тех же видов, а также потребовал бы осуществления. многократных генетических обратных скрещиваний, Поэтому выделение фрагмента. нуклеиновых кислот, способного придать гербицидную устойчивость, и его последующее введение в сельскохозяйственные культуры посредством генетической трансформации позволяет осуществить быстрый межвидовой перенос гербицидной устойчивости и устранить многие из укаэанных ограничений,Многие гены. выделенные иэ одного растения, были введены и экспрессированы в других растениях, нерастительные геныновном как описано в примере 1. Фрагмент рестрикционной эндонуклеазы Яреиз фага 31(размером примерно 8,3 кб), аналогичный фрагменту, содержащемуся в плазмиде рА 6 З 148, но несущий ген Я 1.1 ВВ, кодирую щий гербицидчувствительную АЛС, субклонируют в обеих возможных ориентациях в векторе. Фрагмент рестрикционной эндонуклеазы. Зре 1 - За 1 1 (размером примерно 6,3 кб) из фага 35 и фрагмент Яре- За 1 10 (размером примерно 7,8 кб) из фага 38 субклонируют с получением рА.ЯЗ 5 (АТСС М 67424) и РА Я 38, соответственно. Указанные фрагменты включают 2,5 кб.участка, кодирующего АЛС, в направлении 5 -конца 15 (по направлению вниз), 2 кб АЛС-кодирующей последовательности, кодирующей гербицидустойчивый энзим и 1,8 и 3,3 кб, соответственно, АЛС-кодирующего участка в направлении 3 -конца (по направлению 201вверх), Последние два субклонированных фрагмента содержат сайт рестрикционной эндонуклеазы ВааН 1. Частичные переваривания ВааН 1 или рА Я 35 и рА.Я 38 используют для вставления этих плазмид в сайт 25 ВааНбинарногЬ вектора плазмиды рА 6 Я 135. Гены АЛС в бинарном векторе, обозначенные р 312, р 313, р 351 и р 381 (таблица 7) переносят в Алцгпе 1 асепз путем трехродительского скрещивания, как описа но в примере 1. Введение генов АЛС в гербицидустойчивые клетки табака путем совместного культивирования растительных клеток с 35 Алнее 1 ас 1 епз, несущим гены АЛС, в бинарный вектор проводят по методу, описанному в примере 1 Полученные результаты экспериментов по совместному культивированию представлены в табл.7. Как ожида лось, ген АЛС, изолированный в фаге 31, т,е. ген ЗОВВ, кодирующий гербицидчувствительную АЛС, не дает никаких гербицидустойчивых растительных клеток. Ген АЛС, изолированный в фагах 35 и 38, т.е. ген 45 ЯОЯА-СЗ, кодирующий гербицидустойчивую АЛС, действительно дает растительные клетки, устойчивые к гербициду. Растительные клетки, устойчивые к гербициду, образуются при более низкой частоте, чем 50 растительные клетки, устойчивые к канамицину, а также при более низкой частоте, чем .наблюдается в случае, когда используют ген ЯОВВ - Нга: Это может быть в связи с меньшей устойчивостью к гербициду АЛС-энзи ма. кодирующегося геном ЗОВА-СЗ, по сравнению с АЛС-энзимом, кодирующимся геном ЯОВВ-Нга, либо в связи с более низкой экспрессией гена ЗОВА-СЗ по сравнению с геном ЯОВВ-Нга, либо и с тем. и сдругим.П р и м е р 3, Осуществляют мутации в гене ЗОВА дикого типа табака 1 п ч 1 тго, чтобы он кодировал гербицидустойчивую АЛС. Фрагменты. рестрикционной эндонуклеазы, содержащие часть гена ЗОВА, субклонируют в фаговые векторы М 13 или плазмидные векторы, содержащие начало М 13 репликации для. получения однонитиевой ДНК. Специфический фрагмент ДНК, который субклонирован, зависит от участка, подвергаемого мутагенезу 1 и ч 1 тго, и наличия сайтов рестрикционной эндонуклеазы,Синтезируют олигонуклеотиды длиной16-17 оснований, которые гибридизуются соднонитиевой ДНК из АЛС-гена ЗОВА с одноосновными неправильными подборами.Эти неправильные подборы предназначеныдля превращения аминокислотных кодонов,обнаруженных в гене АЛС дикого типа, вкодоны, обнаруженные в генах АЛС, которые кодируют АЛС-энзимы, устойчивые кгербицидам на основе сульфонилмочевины.Указанные олигонуклетоды содержат фрагменты: .5 6 ТТСААТТ 66 А 66 АТСЗ;для заменыигр 591 наец,5 6 ТСАА 6 Т 66 САС 6 ТА 66 3, для замены рго 197 на а 1 а, и5 6 ТСАА 6 ТОТСАС 6 ТА 66 31, для замены рго 197 на зег,5 АТ 6 ТАССТОА 66 АТАТТ 3, для замены 1 уз 256 на 91 о,5 6 А 66 ТТТ 6 ТТ 6 АТА 6 А 6 3, для замены азр 384 на ча 1,5 А 66 ГГТ 6 А 66 АТА 6 А 6 Т 3, для замены азр 384 на 910,5 ТАСТ 6 АТ 6 АТТТТСА 66 3, для замены а а 205 на азр и5 СА 66 Т 66 СССТТССАТ 6 3, для замены а 1 а 122 на рго.Указанные олигонуклеотиды гибридизуют с однонитиевой ДНК и используют в качестве праймеров для синтеза комплементарнойнити в реакции, катализируемой фрагментом Кленова ДНК-полимеразы 1. Полученную ДНК трансформируют в компетентныеклетки Е,со 11 вцт 1, Отдельные бляшки иликолонии очищают в зависимости от того,использованы ли фаговые векторы М 13 (М 13глр 18/19) или плазмидные векторы М 13(рТЕ 18 В/19 В) начала репликации. Минипродукты. однонитиевой ДНК получают и используют в реакциях секвенирования ДНКдля идентифицирования клонов, несущихмутированные основания.Эти сконструированные и чтго сайтспецифические мутации можно вставлять индивидуально или в комбинации в ген ЗОВА дикого типа, который содержит 5 - и 3 -концевые регуляторные последовательности, необходимые для обеспечения экспрессии гена в растительных клетках (см. пример 2), Такое включение достигают путем замены фрагментов рестрикционной эндонуклеазы, несущих мутации плазмидой, содержащей ген ЗОВА, из которого удален аналогичный фрагмент. Выбор рестрикционного ф рагмента для замены зависит от положения мутации в гене и от наличия сайтов рестрикционной эндонуклеазы, Введение мутированных генов ЗОВА в растительные клетки далее осуществляют по мето,ду, описанному в примерах 1 и 2. Любой из фрагментов ДНК, содержащих мутации, которые приводят к получению гербицидустойчивой АЛС, как раскрыто в описании настоящего изобретения, можно получить в.основном по этому методу, Кроме того, нет необходимости осуществлять мутации только в гене ЗОВА. Аналогичные мутации можно осуществлять в гене ЯОВВ или в любом другом растительном гене, кодирующем АЛС, для которого доступна информация о ДНК-последовательности,П р и м е р 4. ДНК получают иэ Вета моайагз сорта Зеппйа (сахарная свекла), а :геномную библиотекуДНК в векторе ЕМВ 3 бактериофага лямбда конструируют, как описано в примере 1. Рекомбинантные фаги (300 000) подвергают скринингу путем гибридизации с зондом, меченным . Р, фрагмента гена АЛС табака на 5 -конце, как описано в примере 1, Фильтры промывают при 42 С 0,1 ХЗЯС) и выделяют 20 индивидуальных клонов, На второй стадии очистки рекомбинантный фаг гибридиэуютс обоими 3 - и 5 -концами зонда гена АЛС табака. Кроме того, фильтры, которые гидридизированы с зондом 5 -конца. промывают при 55 С. Только. один клон ф 21 гибридиэуется с обоими 5 - и 3 -концами зонда, причем концы остаютря тибридизованнь ми после промывки при:556. Препараты минилизатов ДНК получают из 20 клонов и переваривают с помощью ЕсоВи йсо 1, Различные иэоляты содержат разные фрагменты, полученные в результате обработки рестриктазами, причем. опять только ф 21 гибридизирован с обоими зондами и остается гибридизированным после промывки при 55 С. Один фаг, а именно ф 41, также содержит полосу гибридизации; которая остается после промывки при 550 С, тем не менее он не гибри дизируется с зондом на 3 -конце. Участок, кодирующий АЛС, связывают с фрагментом ВатН- Нпсразмером 3 кб путем гибридизации с зондами из гена ИлаЬасопз на 5 - и 3 -концах, Обе нити ДНК этого фрагмента секвенируют, Фрагмент ВагпН- Нпссубклонируют в векторы рОС 119 или Врегзсгрт; затем генерируют делеции экзонуклеазы Ш или Ва 31, Это осуществляют 10 методом дидезокси-секвенирования, Сравнительный анализ выведенной аминокислатной последовательности, кодируемой геном сахарной свеклы, с этой же последовательностью гена (генов) табака указывает на отсутствие гомологии в первых 88 аминокислотах предполагаемого белка, Указанный участок может представлять собой пептид перехода в хлоропласт. В связи с этим гомология составляет примерно 90 ь в 20 случае вставки 4 аминокислот вокруг остатка 290 АЛС табака. Проверка аминокислотных остатков, которые определяют сайты для гербицидной устойчивости, установляемой в табаке и дрожжах, указывают на то, что указанные остатки консервируются 25 также и в АЛС сахарной свеклы. Полученные данные позволяет осуществить прямой подход к конструированию гена,кодирующего энзим АЛС сахарной свеклы,30 35 устойчивый к гербицидам, посредством сайтспецифического мутагенеза, как описано в примере 3.В этом гене сахарной свеклй подвергают мутагенезу три сайта. Кодон 6 СА для аа в положении 122 заменяют ССА для рго, кодон ССА для рго в положении 197 заменяют С 6 А для аа и кодон Т 66 для тгр в положении 591 заменяют ТТ 6 для еи. Двойные мутации, изменяющие рго на аа в положении 197 и тгр на еи в положении 591, которые имеют сходное действие с геном ЗОВВ-Нга табака; также проводят путем комбинирования двух отдел ьн ых мутаций. 40 45 Для трансформации растений посред- .ством указанных мутаций, сконструированных и чего, в гене АЛС сахарной свеклы, в плазмидный вектор рОС 119 клонируют 50 фрагменты ДНК, содержащие мутации ипроходящие от сайта ВащНразмером примерно 910 п,н.в 5 -концевом направлении (по направлениЮ кверху) кодирующего участка до сайта.Рз 1размером 1000 п.н. в 3 55 -концевом направлении по направлениюкнизу). кодирующего участка. Укаэанные фрагменты вставляют в бинарный вектор рАСЯ 140 для трансформации в клетки растения, как описано в примере 1, Указанный бинарный вектор рА 68140 аналогичен век 43тору рА 68135. га исключением того, что между сайтом ВавН 1 и правой границей Т-ДН К Т 1-плээмиды АогоЬас 1 ег 1 оп 1 товеЮэсепз вставляют ген, который придает устойчивость растениям к антибиотику гигромицину,Введение генов АЛС в табак и сахарнуюсвеклу, чувствительные к гербициду, путем совместного культивирования растительных клеток с помощью Аяовегасепз, несущего гены АЛС в бинарный вектор, проводят, как описано в примерах 1 и 2, Полученные результаты совместного культивирования на табаке представлены в табл.8, Гербицидустойчивые трансфарманть 1 получают с помощью 3 или 4 мутантных генов АЛС сахарной свеклы. Частота вцхода гербицидустойчивых трэнсформантов ниже, чем для трансформантов, устойчивых к канамицину, и ниже, чем частота выхода герби цидустойчивых трансформантов при использовании гена ЯОВВ-Нга табака, Полагают, что это вызвано слабой экспрессией мутэнтных генов АЛС сахарной свеклы в табаке. Вышеукаэанйое можно обьяснить либо недостаточными регуляторными последовательностями нуклеотидов, расположенных по направлению книзу или кверху от мутантных генов АЛС сахарной свеклы в используемых фрагментах ДНК, либо плохой утилизацией регуляторных последовательностей нуклеотидов сахарной свеклы в табаке,Введение генов осуществляют стандартным способом совместного культивирования, Для каждого построения аликвоту совместно культивируемых растительных клеток (исходная концентрация растительных клеток 2 х 105) отмеривают для устойчивости к ялорсульфурону, и другую аликвоту - для устойчивости к канамицину. Селекцию осуществляют при 2 ч, на млрд. хлорсульфурона или при 50 ч. на млн, канамицина,П р и м е р 5. Ге.н Я О й В-Н га, описан ы йв примере 1, трансформируют в культурные сорта табака заражением АогоЬастегов трве 1 асепз пластинок табачных листьев, потомство трансформантов анализируют с тем, чтобы продемонстрировать экспрессию устойчивости на уровне целого растения и наследственность признака гербицидной устойчивости, Затем поступают стандартными стерильными методами для манипулирования стерильными средами и аксенными культурами растений и бактерий, включаяиспользование колпака с ламинарным потоком для всех переносов. Растения табака для заражения листовых пластинок высева ют в чашки и выращиваютв рэстильне: 12 ч при дневной температуре 24 С и 12 ч при ночной температуре 20"С, относительной влажности около 80%, при смешанном холодном белом свете флуоресцентного и накаленного свечения осуществляют заражение пластинок табачных листьев.Молодые листья; не полностью распустившиеся и имеющие длину примерно 4-6 10 ем их в 500 мл 10%-.го раствора С 111 огох, 0,1%-го раствора додецилсульфэта натрия и затем промывают 3 раза стерильной деионизированной водой, Пластины листьев диаметром 6 мм получают из целых листьевс. 20 использованием стерильного бумажного пуансона,Пластины листьев инокулируют погружением их в течение нескольких минут в 20 мл ночной культуры АогоЬастегов (раэбавление 1:10), несущей плазмиду рА 65152. Культуры АогоЬастегов появляются после инокулирования 10 мл бульона М 1 п А (пример 1) с единственной бактериальной колонией, удаленной из бляшки с бульо 25 ном М 1 п А и тетерциклина (пример 8 ),Культуру вырэщивают в течение примерно 17 - 20 ч в стеклянных пробирках (18 мм) с культурой в качалке с платформой типа Йеюч ВгопзюсК поддерживая температуру при 28 С После инокулирования пластины листьев помещают на чашки Петри, содержащие среду с эгаром Сй (пример 6). Чашки герметизируют парапленкой и инкубируют при 40 смешанном освещении для растений, т.е. флуоресцентном и "бго апс Мо" (бепега Еес 1 гс) в течение 2-3 суток в камере для культивирования, где температуру поддер 45. живают примерно при 25 С Чтобы освободить пластинки листьев отАогоЬасегцв и отобрать для выращивания трансформированных клеток табака, пластинки листьев переносят нэ свежую среду СМ, содержащую 500 мг/л цефотаксима и 50 100 мг/л канамицина, Цефотаксим сохраняют в виде замороженного основного раствора (концентрация 100 мг/мл) и прибавляют в стерильных условиях (стерилизуют через 0,45 мкм фильтр) к средэм после автоклэвирования. Свежий раствор канамицина (50 мг/мл) приготовляют для каждого использования и стерилизуют через фильтр, пропуская его вавтоклавированные среды,дюймов (10,16 - 15,24 см), собирают скальпелем с растений табака возраста примерно 4-6 недель (Мсотопа таЬасеп, сорт СЧ,ИК 326 или К 14). Листья поверхностно стерилизуют в течение 30 мин погружени 182091451015 20 в теплицу, где они растут до зрелости, Отдельные. цветки заключают в мешки для то 55П р и м е р 6, Для трансформации гербицидчувствительного.томата в гербицидустойчивый используют ген ЯОВВ-Нга из табака, переносимый на бинарном векторе Пластинки листьев инкубируют в условиях культивирования, описанных выше. в течение 3 недель и затем переносят на свежие среды такого же состава. Всходы возраста приблизительно 1 - 2 недель, развивающиеся на канамицик-отобранных эксплантатах, подрезают стерильным скальпелем и высевают в среде А, содержащей 100 мг/л канамицина, Корне- образование на селективных и неселективных средах регистрируют в пределах 3 недель, Всходы, которые укореняются в канамицине, переносят в почву и выращивают в растильне, как описано выше Через 3-5 недель, но перед тем, как происходит цветение, листовую ткань вырезают и используют для анализа АЛС, как описано в примере 6. Результаты этих анализов, которые указывают на то, что развивается гербицидустойчивая форма АЛС, приведены в табл.9. Растения, проявляющие активность гербицидустойчивой АЛС, затем переносят го, чтобы позволить самооплодотворение без перекрестного опыления, Зрелые семе-. на собирают и осуществляют испытания по качеству потомства для определения наследственности признака гербицидной устойчивости. Семена поверхностно стерилизуют, как описано выше, сушат. и семена сажают на среде 36 (1/4 соли МЯ, 0,75)(, сахарозы.0,8 агара) в присутствии или отсутствии гербицида (0 РХ-Г 6025, Оаззс ). Чувствительные семена прорастают, но далее не . развиваются. Результаты испытания по качеству потомства приведены в табл.9. Сегрегационное соотношение трех устойчивых потомств по сравнению с одним чувствительным потомством указывает на присутствие вставки на одном сайте гена ЯОВВ-Нга в трансформант, который является .стабильно унаследованным. Это наблюдают в 15 случаях из 17 трансформантов. более высокие соотношения устойчивых потомств к чувствительным показывают множественные вставки в несвязанных положениях в геноме. Соотношение 15:1 указывает на присутствие двух несвязанных геков ЯОВВНга, а соотношение 255;1 - на присутствие четырех несвязанных генов ЯОЯВ-Нга в трансформантов К 14 М 40 и К 14 ЬЬ.7 соответственно. 30 35 40 45 50 рА 65152 в штамме Алцпчс 1 аг.оз .ВАИ 04 (см, пример 1),Следуют стандартным от р 1 льньм ме. тодикдм для манипулирйчаниа стРрильных сред и аксенных культур растений и бакге рий. включая использование колпака с ламинарным потоком для всех переносов. Семена томата (1 усорегзсов езсцвпавв сорт НегЬз( Вез СЬеггу) поверхностно егери. лиэуют в течение 30 мин в 10%-ом растворе Сйогох, 0,1 -ом раст воре дедоци сульфата натрия и промывают 3 раза стерильной деионизированной водой. Семена сажают в ящиках Мацеп 1 а (Мацема Согр.). содержащих 100 мл среды с агаром ОМЗ, и инкубируют при смешанном освещении для растений, т.е. флуоресцентном и "бго апб ВЬо" (бепега Еес 1 гс) в растильне, поддерживая в ней температуру около 25 С. Семядоли от всходов 10-15-дневного возраста используют для инокуляции АцгоЬастегогп.Семядоли скарифицируют путем отщепления около 2 мм ткани от каждого конца семядоли при помощи стерильного скальпеля, Скарифицированные семядоли высевают на чашки Петри на среду с агаром СТМ либо в присутствии, либо в отсутствии 75 мкм ацетосирингона (АдгсЬ СЬевса),Для приготовления инокулирования семядолей единственную бактериальную колонию с чашки с агаровой средой Ми А и тетрациклина (1 мкм/мл) инокулирут в колбу, содержащую 30 мл бульона Ми А (пример 1), и выращивают в течение 2 суток при 28 С в качалке с платформой йев ВгопзМсК В то утро, когда инокулируют семядоли, культуру бактерий разбавляют стерильным бульоном Ми А до оптической плотности 0,1 при 650 нМ и ей дают размножаться до оптической плотности 0,2 в условиях выращивания, описанных ранее. Эту культуру затем используют неразбавленной для инокулировдн ия,Чашки с агаром СТМ, содержащие эксплантаты семядолей, наполняют 5:мл бактериального раствора в течение приблизительно 5 мин перед тем, как удалить раствор, Затем чашки закрепляют лентой Тее Таре (ЗЬалтгосМ Ясепбйс ЯресаИу) с двух сторон чашки и инкубируют в течение 2 суток при смешанном освещении для растений, а именно флуоресцентном и "бго аги ЯЬо" (Оепега Еес(гс) при температуре около 25 С.Чтобы освободить растительные культуры от АцгоЬастегогп и отобрать.для выращивания трансформированных клеток томата, зксплантаты семядолей переносят в(РЬагваса) промыванием 5 раз колоночным буферным раствором (100 мМ КН Р 04, р Н 7,5, 0,5 мМ МдС 2, 10% глицерина, 1 мМ пирувата).5, Для засева зкстракционного супернатанта прибавляют холодный насыщенный раствор (Н 4)2 Я 04 с получением 50% фракции. Инкубируют на льду в течение 30 мин,6, Центрифугируют экстракт в роторе ЯЯв течение 20 мин при скорости вращесвежую среду СТМ, содержащую 500 мг/л цефотаксима и 50 мг/л канамицина, и инкубируют их при таких же улсовиях культивирования, которые описаны выше, в.течение приблизительно 3 недель. Затем семядоли переносят в свежие среды с таким же составом и селективными веществами, как и среда СТМ, однако при 1/10 концентрации эеатина.Приблизительно через 2 - 4 недели всхо. ды, развившиеся из канамицинотобранных семядолей, отрезают и высевают в средах ОМЯ, содержащих 500 мг/л цефотаксима и 100 мг/л канамицина. Всходы томата, которые усокренились в канамицине через 2-3недели, переносят в почву в 8-дюймовых (20,32 см) сосудах и накрывают пластмассовыми мешками, Растения выращивают при смешанных флуоресцентном и накаленном свечениях: 12 ч при дневной температуре24 С и 12 ч при ночной температуре 20 С, относительной влажности около 80%, в течение одной недели перед тем, как снять пластмасссовые мешки, Затем растения выращивают еще 2-4 недели и осуществляютиспытание АЛС. В этих экспериментах показано повышение неингибированной активности АЛС в присутствии сульфонилмочевины Ваззс в экстрактах листьев из трансформированных растений (табл,10),Анализ активности АЛС в отсутствии илив присутствии гербицида из трансформированных или нетрансформированных растений осуществляют следующим образом,1, Измельчают 2,5 г относительно молодой листевой ткани (4 - 6 дюймов/10,1615,24 см в длину) Ь тканевом гомогенизаторе, содержащем 10 мл экстракционногобуферного раствора(100 мМ КНРО 4), рН 7,5, 0,5 мМ МдС 2, 10% глицерина, 1 мМ пирувата, 0,5 мМ тиаминпирофосфата, 10 нМ флавинаденийнуклеотида) и 200 мг Роусаг АТ(ВОН ВосЬевсаз). Эту смесь сохраняют нальду,2, Гомогенизируют экстракт в течениеприблизительно 10 с с в политроне(ВгМваппзсгцвептз) при настройке на Иг 7,3. Центрифугируют экстракт в ротореЯогча ЯЯвтечение 20 мин при скоростивращения 16 000 об/мин и 4 С,1020253040 ния 16 000 об/мин и температуре 4 С. Декантируют супернатант.7. Ресуспендируют гранулы в 1 мл холодного колоночного буфера,8. Загружают экстракт на колонку и прогоняют объемом колоночного буферногораствора с получением полного обьема загрузки, равного 2,5 мл. Этот прогон пропускают через колонку,9, Элюируют белки двухкратным объемом загруженного экстракта. Извлекают втрубке Расоп (15 мл), расположенной подколонкой.10. Приготавливают реакцию для каждого экстракта в трубках для микроизмельчения следующим образом: 350 мклреакционной смеси (200 мМ пирувата, 5 мМтиаминпирофосфата, 0,9 мМ фламинадениннуклеотида, 5 мМ КНРОо, рН 7,0), 50 мкллибо 5 мМ КНРО 4, либо нужной концентрации сульфонилмочевины, и 100 мкл растительного экстракта подвергают взаимодействию.11, Инкубируют реакционную смесь втечение 1 ч при ЗООС,12: Для прекращения реакции прибавляют 50 мкл 6 М раствора Н 2 ЯО 4 и инкубируют при 60 С в течение 10 мин, Центрифугируют в микромельнице в течение 5 мин.13, Приготавливают пробирки для развития красок следующим образом: 500 мкл0,5%-го креатина реакционной пробирочной надосадочной жидкости, 0,5 мл раствора а -нафтона (1,5 г а-нафтола в 30 мл2,5 И МаОН), Смесь перемешивают и нагревают при 60 С в течение 20 мин.14. Завихряют каждую пробирку и помещают 100 мкл каждой пробы в резервуарымикротитровых чашек. Снимают показанияпри оптической плотности 530,ВСреда индукции каллюса .1 упаковка солей-МЯ(6 Ьсо МогазпдеОгдапсз Медцв)с 3%-ной сахароэой на 1 л1 мл 1 мг/мл ЙАА РН 5,80,2 мл 1 мг/мл ВАР0,8% агараСйСреда индукции всходов1 упаковка соелй МЯс 3% сахарозы на 1 л1 мл 1 мг/мл МАА рН 5,81 мл 1 мг/мл ВАР0,8% агараАСреда корневой индукции1 упаковка солей МЯБО 1820914 49 10 г сахарозы рН 5,80,8% агараВ-среда АгдоЬассегЬаПрибавляют 7,5 г агара к 440 мл воды,. автоклавируют и сохраняют при 55 С. При бавляют следующие стерильные компоненты: Среда УЕВ 10 ного раствора гербицида на основе сульфонилмочевины можно получить растворением 1 мг гербицида в 100 мл 0.01 К ЙН 40 Н с последующим разбавлением (соотношение 1;10) путем добавления 5 мМ КНРО, рН 7,15 ЙН 40 Н и т д20 Гербицидные разбавления; При прове 25 30 1 мМ МЕЯ3% глюкозыС0,7% агарарН 5,7:Смесь автоклавируют и прибавляют 1 мл 1 мг/мл раствора зеатина.Среда ОМЯ1 упаковка солей МЯ1 мл витаминов В 5 (см, выше) 33 мМ МЕЯ3% сахарозы0,8 агарарН 5,7Среда МЬ А+ 1 мкг/мл тетрациклина1. Прибавляют 7,5 г агара к 400 мл воды.2, Приготавливают основной раствор:К 2 Н Р 04 . 525 гКН 2 РО 4 2,25 г(ЙН 42 ЯО 4 0,5 гЛимоннокислыйнатрий 2 Н 20 0,25 г/100 мл3, Приготавливают и автоклавируют . смесь 20 г/100 мл МдЯ 04 7 Н 204, Приготавливают и автоклавируют 20%-ный раствор глюкозы5. Приготавливают тетрациклиновую смесь (1 мг/мл в смеси этанола и Н 20), которую затем стерилизуют через фильтр (50 об %) 5 40 45 50 0,5 мл 1 М раствора М 9 ЯО 4 0,5 мл 1 М раствора СаО 2 10,0 мл 20%-ной сахарозы 5,0 мл 100 мг/мл канамицина 50,0 мл 10 х солей.(60 г/л йагНРОа 7 Н 2030 г/л КН 2 Р 04;5 г/л ИаС 1;10 г/л ИНаС 1)Среда СТМ1 упаковка солей МЯ1 мл витаминов В 5 (на 100 мл; 100 мгникотиновой кислоты, 1000 мгтиамингидрохлорида,.100 мг пиридоксин, гидрохлорида,10000 мг мионизита) Для получения среды М и А + 1 мкг/мл тетрациклина смешивают (1) и (2), прибавляют0,5 мл (3), 5 мл (4) и 0,5 мл (5),на литрБактомясной экстракт 5,0 гБактодрожжевой экстракт 1.0 гПептон 5.0 гСахароза 5,0 гМ 9 ЯОт7 Н 20 0.5 гАгар (при желании) 15,0 гГербицидные растворы: 1 ч. на млн, основЭта смесь достаточна для испытания гербицида при концентрации 100 ч, на млрд. или ниже. Если требуются более высокие концентрации, растворяют 1 мг в 10 мл 0,01 Й дении стандартного испытания 50 мкл гербицида прибавляют к 450 мкл испытуемой смеси и экстрагируют, для 1:10 разбавления гербицида. Итак, для каждой испытуемой концентрации следует разбавить 10 х раствор в 5 мМ КНРО, рН 7, из основного раствора.П р и м е р 7. Ген ЯОЯВ-Нга табака. кодирующий гербицидустойчивую АЛС, используют для трансформации Вета чйдаг 1 з(сахарная свекла) с использованиемАдгоЬастег оа МаеГасепз. Чтобы поверхностно стерилизировать семена, 50-100 семян помещают в стерильные чашки Петри (25 х 100 мм) в колпаке с ламинарным потоком и прибавляют 25 - 30 мл 70%-го зтанола. Семена перемешивают вручную в течение 1-2 мин, этанол декантируют, после чего прибавляют 25 - 30 мл 20%- го СЫогох(2 С мл коммерческого отбеливателя(80 мл стерильной воды) 1 капля Таееп 80), Семена перемешивают на ротационной качалке при скорости вращения 40 об/мин в течение 20 мин и отбеливатель декантируют. Стерилизацию отбеливателя повторяют 2 раза в течение всего 60 мин, стерилизованные семена промывают 3 раза в течение 5 мин, каждый раз 25-30 мл стерильной водыДля прорастания семян последние высевают на чашки Петри (15 х 150 мм) со средой, отвержденной агаром 1/2 РСо (12 семян на 50 мл среды); и культивируют при 24 С в темноте, П р и м е ч а н и е, 10 - 20%-ноезагрязнение семян можно ожидать для хорошей, чистой делянки с семенами. По этой причине семена высевают далеко друг от друга на больших пластинках и прорастания наблюдают непрерывно, незагрязненные семена.переносят к свежим пластинкам, Если загрязнение грибковое, тогда переносы осуществляют в камере с ламинарным потоком оез вентилирования.60 - 80 О всхожесть семян ожидают для хорошей делянки семян. Прорастание не синхронное. Необходимо приблизительно 14 суток для достижения а) всех всходов и б) достаточной элонгации с тем, чтобы получить много подходящих эксплантов. Получают ночные суспензионные культуры (О/й) АдгоЬастегоя, как описано в примере 1. Заново посеянная АдгоЬас 1 егце имеет более короткий латентный период, чем культуры, сохраняемые в течение длительного времени при 5 ОС. Важно использовать логфазовые бактерии в качестве инокулятов, Поэтому необходимо провести испытание с тем, чтобы обеспечивать пол- учение ночной культуры, которая достигает лог-фазы (оптическая плотность при 550 нм 0,4-0,8) перед инокулированием гипокотилий,Для получения растительных эксплантатов гипотолии разрезают на сегменты около 0,5 см при помощи острого хирургического скальпеля и сразу вцсевают на чашки с Рбо 0,1/0,1, отвержденный агаром. Необходимо следить за тем, чтобы не. случилось высыхания или повреждения раны при использовании тупого скальпеля или при сжатии пинцетом.Для инокулирования эксплантатов последние погружают отдельно в суспензию с лог-фазой соответствующего штамма АдгоЬас 1 егогп. Зксплантаты погружают на короткий срок (1-3 с) и располагают в решетчатой конфигурации на свежей чашке: 25 эксплантатов на 100 мм чашке Рбо 0,1/0,1, огвержденной агаром.Эксплантаты сушат, оставляя чашки открытыми в колпаке с ламинарным потоком в течение 10 - 30 мин. Вследствие этого АдгоЬастег 1 оя концентрируется на бане. Это также может ограничить возможное повреждение, наносимое водой, При этом очень важно следить за тем, чтобы ткань не , повредилась. Требуется тщательное наблюдение за данной стадией. Затем чашки герСреды и структурообразователи метизируют пара-пленкой и культивируют при 24 ОС в течение 3 суток.Зксплантаты собирают в жидкой Р 60,1/0,1, содержащей цефотаксим при кон центрации 500 мкг/мл в чашках Петри(25 х 100 мм), и осторожно встряхивают на ротационной качалке при скорости вращения 40 об/мин в течение 1 ч, Среду декантируют, заменяют свежими противоселек тивными средами и встряхивают осторожнов течение еще 2 ч. Эксплантаты высевают в решетчатой конфигурации на чашки (25 х 100 мм со средой Р 6 0,1/0,1, отвержденной агаром и содержащей цефотаксим (500 15. мкг/мл), и культивируют при 24 С в течение3 сугок,Отбор трансформированных раститель ных клеток осуществляют следующим образом. Эксплантаты переносят на свежие 20 чашки со средой Р 6 0,1/0,1, отвержденной агаром и содержащей 100 мкг/мл ванкомицина или 2 нг/мл хлорсульфурона в качестве. селективных агентов. Число устойчивых колоний подсчитывают через 20 - 30 дней. В каждой ране можно наблюдать более чем одну колонию. Трансформанты отщепляют следующим образом, Каллюс удаляют из раны/экспланта хирургическим скальпелем и культивируют независимо друг от друга на свежих селективных средах. Некоторые АдгоЬастегое могут избежать контрселекииВозможнц дополнительные промывки . в жидких средах, содержащих цефотаксим, а также повторные переносы к цефотаксимсодержащим чашкам, отвержденным агаром. С соблюдением предложенных правил можно установить приблизительно 15 загрязнения эксплантатов, которые являются допустимой потерей; Результаты экспери мента по трансформации с использованием линии клеток Ве 1 а чЫдаг 1 з 87193 сахарной свеклы приведены в таблице 11. Уровень устойчивости к хлорсульфурону в каллюсах В.Чодагз, трансформированной мутантным АЛС-геном ЯОВВ-Нга табака, сравнивают с уровнем устойчивости к хлорсульфурону в нетрансформированных каллюсах, Эти результаты показывают, что ген ЯОЙВ-Нга табака. кодирующий гербицидустойчивую АЛС, может быть эффективно экспрессирован в сахарной свекле.53 1820914 сновные растворы о/л ноте. иоинозит иенты МЗ (1000 Х) Мик 100 м 1005 1,2 0,1 0,1 Растворяют МпС 1 4 Н 20 в разбавленной НС 1.Соединения растворяют отдельно перед тем; как растворяютследующее соединение, Кипятят, охлаждают. рН 4,сох аняютвтемнотеп и 4 С,МпС 124 Н 201820914 К ль ныес е ы Вгзззса па цэ конечная) Кол-во/л Загрузка СредыКомпонент 100 мл1 мл10 мл10 мл0,2 мл3 мл30 г18,2 г8 г0,59 г Соли-макроэлементыМикронутриенты МЗРе ЭДТКВитамины2,4 - РКинетинСахарозаманнитАгарБуфер Мез 1 ОХ 1000 Х 10 ОХ 100 Х 1 мг/мл 1 мг/мл3 мас,/об.1,8 мас./об,0,8 мас,/об.3 мМ Н 5,7, сте илизация автоклзви ованием см), его переносят к среде КВ, содержащей 100 мг/л канамицина. Этот материал регенерируется быстрее. если его высевают на свежие среды каждые две недели. Корни 5 регенерируют на 1/2 МЯ; содержащей 2 мкмВА.В одном эксперименте иэ 100 скарифицированных сайтов (любой конец сектора гипокотиля 0,5 см) 20 развили каллюсовую 10 ткань, которая была устойчивой к канамицину при его концентрации 100 мг/л. Пять из 20 трансформированных линий клеток последовательно индуцируют для регенерации на канамицине, соматические, скрещиваю щиеся, между собой сибсы для каждого регенрирующего генотипа были получены узловым размножением. Эти растения опрыскивают различнымиконцентрациями хлорсульфурона, результаты приведены в табл.12, Двз из 20 пяти трансформантов устойчивы к хлорсульфурону нз уровнях; которые приблизительно в 10 раз выше уровня, летального для контрольных (нетрансформированных) растений,Для дальнейшей демонстрации экс прессии гена ЗОВВ-Нга в трансформированном Вгаэвса парцз осуществляют испытание АЛС в присутствии гербицида хлосульфурон, как описано в примере 6.Сравнивают активности АЛС нетрансфор мировзнного родителя и трансформанта йоч. 5 (табл.12). Результаты приведены в табл,13. В трансформанте наблюдается неуклонное повышение процентной доли ингибирования активности АЛС. Таким 35 образом, ген ЗОВИ-Нга табака, кодирующий гербицидустойчивую АЛС, может экспрессироваться в Вгаэзса парцэ, однако.эта экспрессия не является эффективной.Добавление нуклеотидных регуляторных 40 псоледовательностей Вгазэса парцэ, какожидают, могло бы повысить уровень экспрессии гербицидустойчивой АЛС и уровень выдерживаемости к лиственному введению гербицида1820914 57 Эти стерилизованные на фильтре компоненты прибавляют асептически Вгаззса па из сновные аство ы омпонен Кол-во/л Заг з тав чн 20,5 мМ 18,8 1,56,5 г 19,0 3,7 1,7 4,4 5,0 г: 10 Х ементы и Соли-макроэлемент ОХ 100 Х 1000 Х СаОг 2 Н 20Микронутриенты 30 51,201 ЙаМо 04 2 Н 20 Си 8045 Н 20 СоСЬ 6 НгО Йаг ЭДТК Ге 304 7 Н 20 Миоинозит Тиамин Глицин Никотиновая кислот Пиродоксин Фолиевая кислота Биотин100 ЭДТК . 2,7 100050 20 Витамины Х 0,5 2,0 5,0 0.5 0,5 005 рильные семена промывают 3 раза в стерильной дистиллированной воде и прорастают на среде ОМЗ при 24 С в течение 16-часового дня,Семядоли всходов дыни возраста 7.-14 дней разрезают на срезы 5 мм при помощи нового,острогоскальпеля, Этизксплантаты погружают в культуру А 9 гоЬастебиа с лог-фазой, полученную, как описано в примере 1. Затем эксплантаты переносят к новым чашкам для совместного культивирования и культивируют при 24 ОС в течение 3 суток (16 часов в день). ЙН 4 ЙОЗ КЙОз М 93047 Н 20 КН 2 Р 04 СаО 2 2 Н 20 КЙОзП р и м е р 9. Ген ЗОВВ-Нга табака, кодирующий гербицидустойчивую АЛС, используютдля трансформации Сисиез ве 1 о, сорт АщагИо Очо (дыня).Поверхностная стерилизация семян в значительнойстепени упрощается первоначальным удалением семянной оболочки. За. тем семена старил.изуют промывкой в 70-ном этаноле в течение 2 мин, после чего семена промывают в смеси СЫогох и Твееп (см, пример 7) в течение 20 мин. Сте 3,0250 мМ .1,01,01,53,16,3 мМ100 мМ 2,5 2,01 2,5 92,3 г 19800 м 6200 8625 8301820914 20 ЗО 35 40 50 были экспрессированы в растениях только как химерные гены, в которых кодирующие последовательности нерасгительных генов были сплавлены с растительными регуляторнымй последовательностями, необходимыми для экспрессии генов, Однако было бы трудно ввести гербицидную устойчивость в растения путем введения химерных генов, состоящих иэ бактериальных или дрожжевых генов, кодирующим гербицидустойчивую форму АЛС, поскольку а) эти микробные АЛС-энзимы, как полагают, не содержат специфической сигнальной (транзитной) пептйдной последовательности, необходимой для ввода в растительные хлоропласты, представляющие собой клеточное местоположение растительной АЛС, б) бактериальные изоферменты состоят из двух различных полипептидных субъединиц и в) микробные АЛС-ферменты не могут функционировать оптимально в чужеродной клеточной среде высших растений, Следовательно, существует необходимость во фрагментах нуклеиновых кислот, которые кодируют гербицидустойчивую форму растительной АЛС и которые придают гебицидную устойчивость, когда они введены в гербицидчувствительные растения.Предлагается использование фрагмента нуклеиновых кислот, кодирующего ацетолактатсинтетазу растений, встроенного в конструкцию нуклеиновых кислот, используемую для трансформации растений, содержащих ацетолактатсинтетазу дикого типа, которые являются чувствительными к гербицидному соединению сульфонилмочевины,.причем указанный фрагмент нуклеиновых кислот имеет по крайней мере одну точковую мутацию относительно фрагмента нуклеиновых кислотдикого типа, кодирующего ацетолактатсинтетазу растений таким образом, что при трансформации указанной конструкцией нуклеиновых кислот указанное растение приобретает устойчивость к внесению гербицидного соединения сульфонилмочевины.Сущность изобретения состоит в следующем.Получение фрагментов ДНК, кодирующих. гербицидустойчивую АЛС.Каллюснеые культуры чувствительного к гербициду. табака (й собапа таЬасбв, разновидность ХомЫ) подвергают воздействию сульфомвтуронметила при 2 ч, на млрд; Отбирают устойчивые клеточные линии, обозначенные СЗ и 34, Стандартный генетический анализ растений, регенерированных из этих клеточных линий, показывает, что каждая из линий СЗ и 34 несет единственную полудоминантную ядерную генную мутацию, отвечающую за признак устойчивости к гербициду, а также то, что мутации СЗ и 34 не связаны генетически, т.е. находятся в. различных генах, обозначенных ЗОВА и БОЕВ соответственно. Как показывает анализ, линии СЗ и 54 продуцируют активность энэима АЛС, в 100 раэ более устойчивого к сульфонилмочевинным гербицидам-хлорсульфурону и сульфометуронметилу, чем АЛ С дикого типа. Устойчивость АЛС10 к гербициду в генетических кроссах выделяется вместе с устойчивостью к ингибированию роста гербицидами. Наблюдение двух различных генов, которые мутировали с образованием гербициду- стойчивой АЛС, не было неожиданным, поскольку йлаЬасца, как полагают, представляет собой аллотетраплоид; . образованный иэ йлоаеп 1 озИогаз и й.зучезггз, по существусодержащихдва полных генома. Так, каждая клеточная линия СЗ и 34 содержит один мутант и один ген АЛС дикого типа. Клеточную линию 54 подвергают воздействию сульфометуронметила при 200 ч. на млрд.,избирательная концентрация которого пол 25 ностью ингибирует. рост Я 4, Идентифициру-. ют клеточные линии, устойчивые к 200 ч. на млрд., одну такую линию обозначают Нга. Испытания показывают, что Нга выдерживает концентрации сульфомету- ронметила,которые в 1000 раз выше, чем те, которые требуются для полного ингибированлия роста каллюса дикого типа. Как показывает анализ, линия Нга кросс устойчива к хлорсульфурону. Растения регенерируют из каллюсных культур Нга. Генетический анализ растений показывает, что мутации Нга и 34 связаны, что говорит о том, что линия Нга содержит вторую мутацию в мутантном гене прародительной линии 84, Определяют активность АЛС в экстрактах листьев дикого типа и растениях табака гомозиготного мутанта Нга, Активность АЛС в экстракте из растений мутанта Нга приблизительно в 1000 раз более устойчива к хлорсульфурону,чем активность растений дикого типа Для. того, чтобы клонировать устойчивый к гербициду ген АЛС, ДНК табака выделяют из гомозиготной мутантной линии 34 Й 1 со 1 апа 1 аЬасоа. Порции по 50 г каллюсной ткани замораживают в жидком И 2 и затем лиофилиэуют, Полученную высушеннун ткань потом измельчают при температуре около 23 С в мешалке с использованием 15 секундных. импульсов до превращения в по 55 . рошок. 10 объемов сахарозного буферного раствора (О;3 М сахарозы; 50 мЬ трис-НО рН 5; 5 мМ МцО 2) прибавляют к смеси и полученную суспензию инкубируют при 0 С в течение 5.мин, Суспензию фильтруют черве марлю и цеитрифугируют лри 350 х д в.Бактерии убивают путем промывки зксплантатов втечение 3 ч с осторожным перемешиванием в промывочных средах и культивируют насвежих чашках с селективной средой,Эксплантаты субкультивируют каждые3-4 недели, причем отсекают более компактные, более темно-зеленые секторы от белого ворсистого калласа.Когда "Морфогенный" каллас (оченьтемно-эеленый, компактный, возможно,чуть узнаваемые листья) становится заметным, его переносят к рвгенерационным средам. Ткань может проходить прямо кросткам вместо того, чтобы проходить черезморфогенную стадию, Всходы укореняютсяв корнеобразующих средах. Приблизительно 70 зксплантатов развивают каллас, устойчивый к канамицину при концентрации100 мкм/л. Трансформированный калласпомещают на среды, содержащие возрастающие концентрации хлорсульфурона, ирост в присутствии гербицида определяютвзвешиванием каллюса через 30 дней(табл.14). Некоторые трансформанты растутпри высоких концентрациях хлорсульфуро.на (1000 ч, на млрд) так же хорошо, как и вего отсутствие; например транс 1, транс 2 и.транс 7. Таким образом, ген ЗОВВ-Нйа табака трансформирует дыню и обеспечиваетвйсокий уровень гербицидной устойчивости.Измерения показывают многократноеувеличение веса калласа,СредыОМЗСоли МЗ и Ре ЭДТК 1 хВитамины В 5 1 хСахароза 36МЕЗ 3 мМрН 5,7Агар ф" 0,8Автоклавирование в течение 20 минутОсновная средаСоли МЗ и Ге ЭДТК . 1 хМиоинозит: 100 мг/лТиамин 1 мг/лСахароза 30/МЕЗ 3 мМрН 5,7Агар 0,8%Автоклавирование в течение 20 минВ качестве среды для совместного культивирования используют основную среду плюс:100 мкм ацетосирингона (ацетосирингон хранят как основной раствор 100 мМ в. ДМСО)6 мг/л кинетина1,5 мг/л 1 ААВ качестве промывочной среды используютосновную среду без агара плюс: 500 мг/л цефотаксима6 мг/л кинетина1,5 мг/л 1 ААВ качестве селективной среды используют5 основную среду плюс:6 мг/л кинетина1,5 мг/л 1 АА100 мг/л ванкомйцинаОдно из следующих селективных ле 10 карств в зависимости от конструкцииАцгоЬастег 1 цпт100 мг/л канамицина50 мг/л гигромицина100 мг/л хлосульфурона15 В качестве регенерационной среды используют основную среду плюс;0,1 мг/л ВАР100 мг/л ванкомицинаОписанные выше селективные лекарст 20 ваВ качестве корнеобразующей среды используют ОМЗ плюс:2 мкм 1 ВА100 мг/л ванкомицина25 описанные выше селективные лекарстваП р и м е р 10. Ген ЗОЯВ-Нга табака,кодирующий гербицидустойчивую АЛС,. используют для трансформации Мед 1 садо30 ват 1 ча, сорт йапде 1 апбег.Растения выращивают. и субкультивируют в.ОМЗ, Используемыми материалами являются черешки и сегменты стебелька(длиной 5 мм) .от растений приблизительно35 через 2 месяца после последней субкультуры,Черешки и стебли стерильных растенийразрезают на 5 мм отрезки при помощинового острого скальпеля, Эти эксплантатыпогружают в культуру АцгоЬассегцелог-фа 40 зы, полученную, как описано в примере 1.переносят к свежим чашкам для совместного культивирования и культивируют при24 С в течение 3 суток (16 часов в день),Бактерии убивают путем промывки экс 45 плантвтов в течение трех часов с осторожным перемешиванием в промывочной средеи. культивируют на свежих чашках с селективной средой,Эксплантаты субкультивируют каждые50 3-4 недели. Через приблизительно один месяц заметен трансформированный каллюс,выросший иэ обработанных концов экс- .плантатов, которые отрезают от эксплантата и высевают на свежие селективные55 среды, Когда каллюс становится более организованным (участки более темно-зеленыеи более компактные), его переносят к свежим средам для созревания,Когда появляются развившиеся зародыши, их переносят к средам для прораста 61 1820914. (количестве указаны для ЮО мл загрузки 100 х)Тиамин НС 1 1 гНикотиновая кислота 05 г 40Пиридоксин НС 1 1 гМиоинозит 10 гГлицин 0,2 гСреда для совместного культивирования: 45Основная среда плюс:100 мкм ацетосирингона (ацетосирингон сохраняют в виде смеси 100 мМ в ДМСО)2,4- 0 . 0,5 мг/лВАР 0,2 мг/лПромывочная средаОсновная среда беэ агара плюс:Цефотаксим . 500 мг/л2,4-0 0.5 мг/лВАР 0,2 мг/л . 55 50 ния. После прорастания маленькие растения выращивают на этой же среде.Менее 1 О эксплантатов развивают каллюс, устойчивый к канамицину при концен-, трации 100 мг/л. Канамицинустойчивые 5 секторы находят устойчивыми к гербициду хлорсульфурон при концентрации 50 ч. на млрд. Из канамицинустойчивого каллюса получают 3 всхода. Ткань иэ этих трансформантов испытывают на гербицидустойчивый 10 рост при разных концентрациях хлорсульфурона, Один трансформант способен расти при концентрациихлорсульфурона 1000 ч.на млрд. Остальные два способны расти при 5000 ч. на млрд. Таким образом, ген ЗОЯВ Нга табака может использоваться для трансформации люцерны и обеспечивает высокий уровень гербицидной устойчивости.даплюс0,5 м/м0,2 мг/л100 мг/лщих селективности от констр50 мг/л100 мг/л Селективная среОсновная среда2.4-0 лВАРВанкомицин.Одно из следую ых лекарств, в зависим укцииА 9 гоЬассег 1 на .ГигромицинХлорсульфуронСреда для созревания:то же, что и селективная среда, но без2,4 - 0Среда для прорастания:Основная среда плюсванкомицин 100 мг/лСелективноелекарство, как описано выше,Формула изобретен и яСпособ получения двудольных растений, устойчивых к сульфонилмочевине, предусматривающий получение суспенэионныхкаллусных культур, отбор клеток, культивирование каллусной ткани и получение регенераторв, устойчивых к гербициду, о т.л и ч аю щ и й с я тем, что перед получениемсуспензионных каллусных культур конструируют рекомбинантную плазмидную ДНКрНгеВ 1 йрА 6 З 152, или р 735114, или р 7350,или р 735 Н, или р 73592, или рМ 78; или рМ 7 А.или рМ 7 СА, или рМ 708, или рМ 7 Н 8, илирМ 7 АО, или рМ 7 АН, или рМ 7 А 92, илирМ 7 А 8, или р 6 ЧКАР, или рА 6 З 589, илирА 6 З 596, или рНОЗ 594, или рА 6 З 591, илир 5 Т 350, или р 5 Т 35 Н, или рА 6 З 351, илирА 6 З 381, или рА 6 З 140 с геном ЗОЙВ-Нга,кодирующую мутантную ацетолактатсинтезу табака, в которой А 1 а 122 замещен на Рго,или Рго 197 на А 1 а, или Рго 197 на 61 п, илиРго 197 на Зег, или А 1 а 205 на,Азр, или Тгр591 на 1 ен, или А 1 а 122 на Тго и Тго 591 на1.ен, или Рго 197 на А 1 а и Аа 205 на Азр, или Рго197 на 61 п и А 1 а 205 на Азр, и Рго 197 на А 1 аи Тгр 591 на .ен, или Рго 197 на 61 п и Тгр 591.на Ьеи, или Рго 197 на Зег и Тгр 591 на 1 ен,или А 1 а 205 на Азр и Тгр 591 на 1.ен, илиацетолактатсинтетазу АгаЫоборз 1 з, в которой Рго 197 замещен на Зег, или ацетолактатсинтетазу сахарной свеклы, в которой Аа122 замещен на Рго, или Рго 197 на А 1 а, илиТгр 59 на 1 ен. или Рго 197 на А 1 а и Тгр 591на 1.ен. и трансформируют полученнымиДНК клетки Вгазз 1 са, или картофеля, илитабака, или сахарной свеклы, или дыни, илихлопчатника, или люцерны и отбираюттрансформированные клетки,1820914 ч 64 Таблица 1 Результаты каллюсовых тестов табака, зараженного ОЧКЙТ 13,Количество трансформированных ростковых эксплуантатов, продуцирующих каллюс на селективных и неселективных средахТаб нтанные мутации дрожжевого гена АЛС, приводящие к устойчивости к сульфонилм винному гербицидуШтамм АдгоЬас 1 егцв, содержащий плазмид ген ЙОЗ/ЙРТИ (канамицинустойчивость)Штамм АдгоЬас 1 ег 1 ца, содержащий плазмидШтамм АдгоЬастег 1 ца, содержащий плазмид табака, либо гена ИОЗ/ЙРТ 11). Т 1, несущую ген АЛС табака иТ 1, несущую только ген ЙОЗ/ИРТ 11Т 1 (лишенную либо гена АЛС65 182094 Тв.блицами Сайт-направленные мутации дрожжевого гена АЛС, приводящие к устойчивости к сульФонилмочевинному гербицидуАми Кодон дикого типанокислотноеамещение 122 ОСТ А 1 а ОСТ А 1 а 256 ДАО 1 уз 359 АТО Мес 384 ОАС Азр 591 ТОО Тгр Т(Т ОТТ АСТ ССТ ААТ АТТ ЯТ СОТ СТТ , ТТ ТЯТ ТТТ ОАА дЯ АЩ ТИ СЯТ ТОТ ОАФ ТОО ОАС 666 СТО ССО ТОО ССА САОС.СЬ ТОО ТСС ООТ ТОС ААА ОАС ОАО ТТ(; САС ТА(; АТА ОТО ААОАОО АТО ЯАС САО 6 Бег Ча ТЬг Рго Азп Ие Нз Агд 1 ее Туг Суз РЬе 61 ц Мет 1.уз61 п Тгр Агу Суз Оо Тгр Азр 61 у 1 еи Рго Тгр Рго 61 о Рго Тгр Бег 61 у Суз 1 уз Азр 6 у РЬе Н 1 з Туг Ие Ча уз Агу Мет Азп 61 п ТЬг1820914 68. 67 Таблица 4 Перенос ДНК из фагового клона 1 в чувствительные клетки йлаЬасищ Некультивируемые совместно (контрольные) р Растительные клетки, культивируемые совместнплазмиду рА 68145, с канамицинустойчивым экспрессии гербицидчувствительной АЛС из из фагового клона 3 в чувствительные клетки йлаЬас Перено контрольные) растительные клетки,емые Совместно с АЛоае 1 ас 1 епз, содержащимнустойчивым векторомуемые совместно с Алове 1 ас 1 епз, содержащистойчивым вектором, содержащим фаговый кло тивируемые совместно ( ьные клетки, культивиру иду рА 63112, с канамици льные клетки, культивир у рА 63152, с канамиций нЗ лица хлорсульфурону в клетках йлаЬасц ных мутантным геном АЛС вень устойчивости рта 9 Ч 38,трансф в е хлорсульфурона.нных (контрольных) растительных растеысеянных при каждом уроченные из некультивиро лученные в результате совместного культивирования (контрольньвх),ых клеток с АливИас епз, содержащей рА 63152 и первоначально селека счет устойчивости к хорсульфурону при концентрации 2 ч/млрд Некуль70 69 1820914 Таблица 7 мые совместно с Алшпмые совместно с Алиеориен- тация 1),ые совместно с Аливеия 2).мые совместно с Алиемые совместно с Алия е 1 ас 1 епз, содержае 1 ас епз, содержаас 1 епз, содержащим 2. Растительные клетки, культивируе щим рА 68152, субклон 34/Нга. 3; Растительные клетки, культивируе. щим рА 68312, сублокан СЗ, ф 31 ( 4, Растительные клетки, культивируем рА 63313, субклон СЗ, ф 31 (ориента 5. Растительные клетки, культивируе щим рА 68351, субклон СЗ, ф 35,6. Растительные клетки, культивируе щим рА 63381, субклон СЗ, ф 38.1 асепз, содерж ас 1 епз, содержаа Таблормированных сайтспецой свеклы астительных клетках, транмутантными генами АЛС саха Гербицидная устойчивость скимии а 9 Эксперимент 3 по пав горному введению АЛС Перенос ДНК иэ фаговых клонов 31, 35 и 36 к чувствительным клегкам йлаЬасип Число колонийобраэующих единиц, происходящих от 10 протопластных эквивалентов череэ один месяц после совместного культивированиянеигнибированной активности АЛС сегрегационное соотношение устойчивое/чувст- вительное 1000 ч, на млрд 100 ч. на млрд Активность АЛС в каждой линии относитСя к активности в отсутствие гербицида, которая принимается эа 100, Используемый гербицид на основе сульфонилмочевины представляет собой ОРХ-Р 6025 (61 азз 1 с ) при концентрации 10 ч,на млрд; Устойвое потомство способно расти при:укаэанных концентрациях гербицида ОРХ-Р 6025 (Сазз 1 с ),Таблица 10 Активность АЛС томатов трансформированного и дикого типов 11.фотносятся к активности в отсутствие гербицида, ко.ачестве соединения сульфонилмочевины испорьэуся действующим началом в гербициде 6(азз 1 сф. Активности АЛС в каждой линии торую принймают эа 100. В к ют ОРХ-Г 6025, которое являет б 193 Веса чо 19 аг 1 з, трансформируемсущим плаэмиду,рА 68152.формированная линия 87193 Веса ч Линия 8 с 1 епз,Нетран1820914 Т лиц 1 10 ч. на млн. аблица 1 и трансформированного Вгазз 1 са париз о отношению к активности в отсутствие гербиц 00. Используемым соединением сульфонилмОРХ-ЧЧ 4189), который представляет собой дейсй аблица 14нормальный рост, никакой осевойуменьшенный рост, сублетальны+ уменьшенный рост, летальный- летальный, ктивность АЛС Вгаззса паров диког Активности АЛС данй рая принимается за ется хлорсульфурон ло в гербициде 6 еаптечение 10 мин, Ядерный осадок в виде гранул ресуспендируют в лизисном буферном растворе 20.мМ ЭДТК, 50 мМ трис-НС рН 8, 1% Загсову), прибавляютСзС с получением 0,95 г на мл буферного раствора и полученную смесь центрифугируют при 17000 х д в течение 20 мин при 4 С. Зтидий бромид прибавляют к полученному супернатанту до концентрации 400 мкг на мл, показатель преломления регулируют до 1,39 и полученный раствор центрифугируют йри 90000 х д в роторе типа ВесЬпап Т 70 при 20 С в течение 3 суток. Полученную флуоресцентную полосу ДНК отщепляют от градиента и обрабатывают изопропанолом для экстрагирования этидий бромида, В заключение ДНК диализуют против буфера ТЕ и осаждают путем прибавления этанола,Из этой ДНК получают геномную библиотеку йсобапа следующим образом, используя лямбда-вектор фага ЕМВ.4. Фаг ЕМВ 4 получают из биомассы с агарозных чашек, Получают фаговую ДНК путем концентрирования. фага полиэтиленгликолем, удаления полиэтиленгликоля хлороформом и очистки фага с использованием ступенчатых градиентов глицерина, Полученный очищенный фаг затем обрабатывают дезоксирибонуклеазой и фрибонуклвазой перед экстракцией фенолом. Фаговую ДНК извлекают из этаноФа. Для получения плеч фага ЕМВ.4 фаговую ДНК псоледовательно гидролизуют эндонуклеазами Заи Вагл Н. Плечи отжигают и затем отделяют от центрального фрагмента на 10-40%-ном сахарозном градиенте. Плечи. полностью денатурируют и повторно.отжигают перед лигированием к ДНК табака. ДНК табака, полученную описанным образом, частично обрабатывают эндонуклеазой ЗАОЗА и осаждают посредством градиента 10-40%- ной сахарозы, Фракции от сахарозного градиента затем анализируют электрофорезом на 0,5%-ых агарозных гелях. Фракции, содержащие фрагменты в диапазоне размеров 20 - 40 кб, диализуют, осаждают и лигируют к плечам ДНК лямбда-фага, ДНК лигируют при концентрации 135 мкг на млвектора и 45 мкг на мл вставки ДНК, Полученные лигированные контактамеры затем упаковывают с использованием экстрактов .упаковки лямбда-ДНКВыход 5 фага состав.- ляет приблизительно 4,5 х 10 фагов на мкг вставки ДНК. Конструируют библиотеку из приблизительно 400000 фагов, представляющую примерно.99%-ную полную библиотеку для табака, которая имеет приблизительно геномное содержанием 1,65 пикограммов или 1,52 х 10 .пар оснований;Полученную фаговую библиотеку ДНКЙ сотапа выращивают и высевают на чашки на штаммеЕ 392 Е.со АТСС 33572), Фаги высевают на чашки с получением 2000 - 5000 5 пятен на 90 мм чашках Петри или 50000пятен на 150 мм чашках Петри. Вслед за переносом фаговой ДНК к нитроцеллюлозным фильтрам последние предварительно гибридизируют путем инкубирования в те чение приблизительно 4 ч при 560 С в 6 хЗЗРЕ, содержащем 0,5% ЗОЗ, 100 мкг на мл денатурированной ДНК телячьего тимуса и 10 х раствора Оеп багдад, На этой стадии прибавляют свежую аликвоту гибридизирован ного раствора вместе с приблизительно 10отсчетов в минуту радиоактивного зонда гена дрожжевой АЛС. Гибридизацию проводят в течение 24 - 48 ч при 56 С. В этот момент фильтры вначале промывают в тече ние приблизительно 4 ч вбхЗЗРЕпри 56 С,затем промывают еще трижды в течение 20 мин каждый раз в 2 х ЗЗРЕ при температуре около 23"С, Затем фильтры сушат и подвергают воздействию ретгеновской пленки 25 Кобами ХАЯ илиЯР и усиливаютего экранаОо Ром СгопеР.дйппд Риз при -70 С в течение 2 дней. Открытые места на пленке указывают положение пятен, потенциально содержащих гены АЛС ИсоОапа. 30404550 Голученные авторадиограммы затем ориентируют над первоначальными, бактериофагсодержащими чашками Петри, С использованием широкого конца стерильной пастеровской пипетки вырезают пятна, соответствующие наиболее темным местам наавторадиограммах. Собранные пятна затемэлюируют в буфер ЗМ и высевают на свежие чашки Петри диаметром 90 мм. Каждая чашка получает около 100-200 фагов, Затем повторяют полный процесс определения местоположения фагов, используя вновь приготовленный зонд, Таким образом повторяют стадии определения местоположения и выделения фагов до тех пор, покабольшинство пятен не покажет присутствие фага, содержащего ДНК, способную гибридизироваться к зонду гена АЛС дрожжей,Выделяют мини-препараты ДНК из очищенного от пятен фага, обозначенного йт А 13. Продукты переваривания мини-препаратов ДНК с помощью рестрикционной эндонуклеазы Есой подвергают электрофорезу через 0,7% агарозные гели и блоттингу нанитроцеллюлозных фильтрах. Фрагменты, содержащие ген АЛС, затем идентифицируют путем гибридизации с зондом дрожжевого АЛС-гена, Фрагменты, способные гибридизироваться в зондом, затем выделяют и субклонируют в векторы рВЯ 322, 1820914 10.М 13 гпр 9 или М 13 пзр 18. Эти фрагментыдалее Н 1 пб П 1 и ВагпН 1 у нуклеотидов 1540 и 2518,секвенируют с использованием олигонуклео- соответственно;тидных праймеров методом дидезокси-тер- . г) последовательность ВагпН 1-Оэ 1минирования цепи. Используют комплект длиной 702 пн, содержащая 3 -участок генаприборов, поставляемый йеа Епдапб 5 нопалинсинтазы (нуклеотиды 848 - 1550).В 1 оаЬз,Использованиесинтетическихолиго-Нуклеотидная последовательность унуклеотидныхпраймеровпозволяетосущест- слияния йОЗР и кодирующей последовавить растяжение ДНК-последовательности тельности й РТ 11 выглядит следующимвдоль клонироаанногофрагментааперекры- . образом: последовательность йОЗвающихся сегментах. С помощью ЭВМ-ана последователь. ность йРТлиза последовательности ДНК идентифи- ААТААТСТОСАОСААОСТТОСООООАцируют открытую рамку считывания 667 ко- ТСОТТСО С АТОдов. Выведенная аминокислотная последа- Рзт 1 Н 1 пб П 1вательность этой открытой рамки считывания Вектор рКйК расщепляют рестрикцион. в основном гомологична последовательно ным энзимом За 1(ВВ.), полученный линейстям, ранее определенным иэ гена 11 Н 2 ный вектор после экстракции феноломЗассЬаговусез сегеч 1 з 1 ае и гена Ичб Е.соП, соединяют в присутствии ДНК-лигазы Т 4 счто указывает на то, что фрагмент ДНК, вос- очищенным фрагментом Яа 1 1(2,1 кб), несустановленный из геномной библиотеки щим бэктериальный ген неомицинфосфотй 1 собапа, содержит ген АЛС табака. Для 20 рансферазы 1(йРТ 1) в качестве селектирутого, чтобы определить, кодируетли этот ген емого маркера для бактериальной устойчиАЛС гербицидчувствительный энзим дикого вости к канамицину. Лигазную смесь испольтипа или мутантный гербицидустойчивый .вуют. для трансформации компетентныхэнзим из линии 34, ген вводят в гербицид- клеток НВ 101 Е.со, и трансформанты сечувствительный табак дикого типа путем 25 лектируют на чашках, содержащих 100 мг/лтрансформации, опосредственной АдгоЬас- канамицина. Полученную рекомбинантную1 ег 1 це 1 ове 1 ас 1 епз. плазмиду, обозначенную рКйКЯ, подвергаТребуется генетический маркер для от- . ют очистке.бора трансформированных растительных Плазмиду рКйКЯ расщепляют рестрйкклеток. Используют устойчивость к антиби ционным.энзимом Есо й 1(ВВ 1) и ее концыотику О, получаемую в результате того, затупляют фрагментом Кленова (ВВЦ, Пол. чтобактериальный ген йРТ 11, кодирующий ученную линейную ДНК соединяют в принеомицинфосфотрансферазу, экспрессиру- сутствии ДНК-лигазы Т 4 (йее Епд 1 апбется в растениях. Для осуществления экс- . 81 оаЬз) с фосфорилированными линкерамипрессии ЙРТ 11 регуляторные последова Вд П. Вслед за экстенсивным переваривательности растений синтезируют с участком нием рестрикционным энзимом Вд П (ВВ 1 )кодированияйРТ 1.1 ввекторерКйК.Вектор для удаления избыточных линкеров ДНКрКйК происходит от часто используемой пропускэютчерезколонкугель-фильтрацииплазмиды рВВ 322 в результате отщепленияСефадекс О(очищенный) с тем, чтобысайтов Н 1 пбП и Вапг Н 1 и вставки в сайт Са 40 отделить ее от линкеров, Фрагмент ДНК вы- .фрамента Оа 1(приблизительно, 2,3 кб), деляют и обьем регулируют с получениемкоторый состоит из следующих компонен- концентрации ДНК около 78 мкг/мл, 1 мклтов: ДНК сэмолигируют в присутствии ДНК-лиа) последовательность Оа 1-Вд П дли- газы Т 4 в общем обьеме 5 мкл и используютной 320 пн, содержащая промоторный уча для трансформации компетентных клетоксток гена неомицинфосфотрансферазыНВ 101 Е.со, Ампициллинустойчивые клет(ййТ П) транспозона Тп 5, происходящего а ки содержат плазмиду рКйКЗО, котораярезультате преобразования сэйта Нпб:П 1 в идентична плээмиде рКйКЯ за исключенисайт Оа 1; ем того. что рестрикционный.сайт Есой зэб) последовательность ЗаО ЗА-Рз 1 1 50 мещен сайтом Вд П,длиной 296 пн, содержащая промотор нопа- Ф рагмент Ягпэ 1 фага йтА 13 содержитлинсинтазы (йОЗР), происходящий от гена участок, который гибридизируется к дрожнопалинсинтазы (й 05) (нуклеотиды -263 до жевому гену АЛС. Фаг МА 13 частично пере+33), относительно сайта начала транскрип- варивэют рестрикционным знзимом Ягпэ 1 иции, путем создания сайтэ Рзт 1 кодона ини вслед зэ экстракцией фенолом присоединяциации; ют к фосфорилированным лин керэм Вэв Н 1в) последоватеьность Н 1 пб П 1-Вагп Н вприсутствииДНК-лигэзы Т 4. После гидродлиной 998 пн, содержащая кодирующую лиза ВааН 1 и удаления избыточных линкепоследовательность для гена ййТ 11, проис- ров путем электрофореза на эгэрозном гелеходящего от Тп 5, путем создания сайтоа рестрикционный фрагмент ВэвН (16 кб),82091410 15 20 25 30 35 40 50 55 содержащий АЛС-ген табака от фага МА 13, выделяют из геля эпектроэлюированием и используют для дальнейшего клонирования.Вектор рКИКЗО линеаризуют рестрикционным знзимом Вд(ВЮ) и вслед за дефосфорилированием кишечной .фосфатазой теленка его присоединяют в присутствии ДНК-лигазы Т 4 к рестрикционному фрагменту (16 кб) ВааН , происходящему из фага ЙтА 13, Лигазную смесь используют для трансформации компетентных клеток НВ 101 Е,со и отбирают ампициплинустойчивые трансформанты, которые. содержат рекомбинантную плазмиду., обозначенную рЧ 13. Ориентация фрагмента-вставки в рЧ 13 такова, что рамки считывания гена НОЯ;йРТ в векторе и гена АЛС во вставке находятся в противоположных направлениях. После очистки тремя штриховыми разводками одной колонии НВ 101 (рЧ 13) используют для трехродительского скрещивания, 3 мл ночных. культур НВ 101 Е,со (рЧ 13) и НВ 101 Е.со (рВК 2013) (номер АТСС 37159) в средеВ, содержащй 25 мг/л кэнамицина, выращивают при 37 ОС, а ОЧ 3850 АдгоЬастегцгп вве 1 асепэ - в средеВ при 28-29 С, Клетки собирают при ком-. натной температуре в клинической центрифуге, промывают один раз в среде .В, не содержащей лекарства, собирают и ресуспендируют в 3 млВ. 0,25 мл аликвоты всех трех штаммов смешивают в пробирке и смесь переносят на миллипоровый фильтр (2,5 см НАЧЧР, 0,45 мкм), помещенный на поверхности трех фильтров из ватманской бумаги М 1 в чашке Петри. После того, кэк вся жидкая среда абсорбирована ватманским фильтром (около 30 мин), миллипоровый фильтр с бактериями на его верхней поверхности кладут (сторона с бактериями показывает наверх) на чашку со средойВ беэ лекарства. После инкубирования в течение ночи при 28-29 С миллипоро.вый фильтр переносят к 5 мл 10 мМ раствора М 9804 и завихряют с тем, чтобы ресуспендировать бактерии в.растворе. 0,1 мл аликвоты высевают на чашки с .селективной средой чашки с минимальной средой М 9, содержащей 20 сахарозу, 1 мМ Мд 304, 1 мМ СаС 2 и 1 мг/мл канамицина (Ядгла). Через примерно 4 дня инкубирования при 28-29 ОС проявляются несколько больших колоний, Очищают несколько трансконъюгантов тремя последовательными штриховым разводками (одноколониевыми) на тех же селективных чашках, Ожидают росттолько АдгоЬэстегцгп, содержащих плаэмиду рЧ 13, вновь объединенную с эндогенной плазмидой рбЧ 3850 за счет их общих последовательностей рВВ 322. Это подтвердилось анализом "Яоцйегп" перед использованием изготовленной АдгоЬэстегца, 6 ЧКМТ 13 для трансформаций растений,Для трансформации растительных клеток следуют стандартным асептическим методикам для манипуляции стерильными средами и аксенными растительно-бактериальными культурами, включая использование колпака с ламинарными потоками для всех переносов. Составы сред представлены в примере 6, Консервированные растения табака для заражения листовых пластин выращивают в растильне; 12 ч при дневной температуре 24 С и 12 ч при ночной температуре 20 С, относительной влажности около 80, смешанном свете флуоресцентного и накаленного свечения. Осуществляют заражение листовых пластин табака. Молодые листья, не полностью распустившиеся и имеющие приблизительно 4 - 6 дюймов (101,6 - 1523 вам) в длину, собирают скальпелем с растений табака (чсотапа таЬасцв, разновидность Хапй) приблизительно 4 - 6-недельного возраста. Листья поверхностно стерилиэуют в течение 30 мин погружением их в около 500 мл 10-го СЫогох, 0;17;-го раствора додецилсульфэта натрия и затем промывают 3 раза стерильной деионизированной водой, Листовые пластины диаметром 6 мм получают иэ целых листьев с помощью стерильного бумажного пуансона.Листовые пластины инокулируют погружением их в течение нескольких минут в 20 мл ночной культуры (разбавление 1:10) АдгоЬастегцт, несущей ппаэмиду ОСКЙТ 13. Выращивание культуры АдгоЬастегцв начинают инокулированием 10.мл бульона УЕВ единственной бактериальной колонией, удаленной из чашки со средой й-агара, Культуру выращивают приблизительно 17 - 20 ч в 18 мл стеклянных пробирках с культурой в качалке с платформой йеа ВгцпэасК поддерживэя температуру 28" С.После инокулировэния листовые пластины помещают на чашки Петри, содержащие среду агара СМ, Чашки герметизируют парапленкой и инкубируют при смешанных флуоресцентном и "Сго эпд 5 Ьо" освещениях для растений в течение 2 - 3 дней в камере для выращивания культур, где поддерживается температура около 25 С.Чтобы избавиться от листовых пластин АдгоЬастегцв и отобрать для выращивания трансформированных клеток табака, листовые пластины переносят на свежую Сч-среду, содержащую 500 мг/л цефотаксима и 100 мг/л канамицина, Цефотаксим сохраняют в виде замороженного 100 мг/мл основно 13 1820914го раствора и прибавляют асептически (стерилизуют через 0,45-микрометровый фильтр) к средам после автоклавирования. . Свежий раствор канамицина 150 мг/мл) приготавливают для каждого использования и стерилизуют через фильтр, пропуская его в аатоклавированные среды.Листовые пластины инкубируют в описанных условиях в.течение 3 недель и затем переносят на свежие среды такого же состава.Приблизительно через 1 - 2 недели всхо 10 ды, развивающиеся на среде, содержащей канамицин, подрезают стерильным скальпелем и высевают в среде А, содержащей либо 100 ч. на млрд. хлорсульфурона, либо 15 100 мг/л канамицина. До истечения 3 недель регистрируют корнеобразоаание на для определения уровней устойчивости к хлорсульфурону и канамицину в проводимом испытании на каллюсовую индукцию на 25 селективных средах. Для индуцирования образования каллюса отрезают маленькие листья, которые разрезают, на несколько .участков с помощью скальпеля и засевают в В-среду, содержащую либо 10 ч, на млрд, хлорсульфурона, либо 50 мг/п канамицина. До истечения 3 недель регистрируют каллюсовой рост на селективной или неселективной средах,Приведенные в табл.1 результаты указывают на то, что трансформация табака 30 35 была достигнута с помощью штамма СЧКИТ 13 на основе получения канамицинустойчивого каллюса, Канамицинустойчивый калпюс остается чувствительйым к сульфонилмочевинному герб ициду хлорсул ьфурон, что означает, что ген АЛС, выделенный из мутанта З 4 табака в фаге 1 чта 13, кодирует 40 гербицидчувствительный энзим дикого типа, Этот ген АЛС растений использовался в качестве зонда гибридизации ДНК для выделения других растительных АЛС генов, включая гены, которые кодируют гербицидустойчивую АЛС.Геномную библиотеку ДНК из мутанта 45 50 Нга табака конструируют в бактериофаге лямбда и подвергают скринингу на клоны, . которые гибридизируются к гену АЛС табака дикого типа из мутанта Я 4. Выделяют несколько фаговых клонов. Физическое картирование ДНК-вставок табака с использованием рестрикционных эндонуклеаз выявляет присутствие двух различных классов фрагментов ДНК, представляющих два гена АЛС: ЗОВА и ЯОВВ, Сравнение физических карт генов ЯОВА и ЯОВВ й.таЬасца селективной и неселективной средах.В течение 2 недель посева удаляют маленькие листья с подрезанных проростков с картами от прародительских видов показывает. что ген ЗОВА происходит от й.зуЬестг 3, а ген ЯОВВ происходит от НлоаептозОоггп 1 з. Ген АЛС дикого типа, выделенный ранее иэ мутанта Я 4. обозначают ЗОВА. Генетическое сцепление гербицидустойчивой мутации высокого уровня в Нга с мутацией Я 4 показывает, что мутация Нга наблюдается в том же гене АЛС, что и мутация Я 4, а именно в ЯОВВ, Следовательно, ожидается, что ген ЯОВВ, выделенный из мутанта Нга, должен быть мутантным геном, обозначенным ЗОВВ-НВа и кодирующим гербицидустойчивую АЛС, Выбирают один фаговый клон, содержащий ген ЯОВВ - Нга. для дальнейшего анализа, Этот фаговый клон, обозначенный 3, депонирован в Американской коллекции типовых культур, Рокаилл, Мэрилэнд, под каталожным номером АТСС 40237. Фаговый клон переваривают рестрикционной эндонуклеаэой Яре 1 с получением ДНК-фрагмента (8,3 кб), который вставляют в сайт ХЬа плазмиды рМас 19, и полученную рекомбинантную плазмиду рА 6 Я 148 депонируют а Американской коллекции типовых культур, Роквилл, Мэри- лэнд, под каталожным номером АТСС б 7124, Плазмиды рА 6 Я 148 и рА 65135 лигируют одну с другой, как описано ниже, и полученную рекомбинантную плазмиду рА 6 Я 152 вставляют аВА, 4404 АдгоЬастегов 1 ище 1 асепз. Полученную 1.ВА 4404 (рА 6 Я 152) АогоЬас 1 егив тцще 1 асепз депонируют в Американской коллекции типовых культур под каталожным номером АТСС 6712 б.Геномную библиотеку ДНК из.мутанта СЗ табака конструируют в бактериофаге лямбда и подвергают скринингу на клоны, которые гибридизируются с ранее выделенными генами АЛС из табака. несколько фаговых клонов выделяют, после чего ДНК-вставки табака физически картируют рестрикционными эндонуклеазами. Идентифицируют два различных типа фрагментов ДНК, соответствующих гену ЯОВА-СЗ и гену ЯОВВ. Для дальнейшего анализа отбирают два фаговых клона, обозначенных 35 и 38 и несущих ген ЗОВА - СЗ.Фаговый клон 35 переваривают рестрикционными эндонуклеазами Яре 1 и Яа 1 .1 с получением фрагмета ДНК 6,3 кб). Этот фрагмент ДНК вставляют в плазмидный вектор рОС 119, переваренный рестрикционными зндонуклеазами ХЬАи Яа 1, и полученную рекомбинантную плазмиду рА Я 35 депонируют в АТСС, Роквилл, Мэрилэнд, под каталожным номером АТСС 67424,Кроме четырех генов АЛС табака, а именно ЗОВА и ЯОВВ, кодирующих герби 1820914цидчувствительные АЛС дикого типа, и БОКА-СЗ и 5 ОВВ - Нга, кодирующих мутантную гербицидустойчивую АЛС, гены АЛС выделяют из АгаЬЫорзз тра 1 апа; Ве 1 а чи 9 агз (свекла сахарная) и часть гена АЛС выделяют из 2 еа гпауз (кукуруза). Последние гены АЛС из гербицидчувствительных.растений получают из геномных библиотек ДНК, сконструированных в бактериофаге лямбда скринингом на ДНК, гибридизирующуюсяс ранее выделенным геном АЛС из дрожжей или табака. Ген АЛС дикого типа из сахарной свеклы выделяют в фаге, обозначенном Ф 21, и физически картируют рестрикционными зндонуклеазами. Плазмида рВА 8216 депонирована в АТСС, Роквилл, Мзрилзнд, под каталожным номером 67425.Гены, кодирующие гербицидустойчивые знзимы АЛС, выделены из спонтанных мутантов дрожжей, устойчивых к сульфонилмочевине. Секвенирование этих генов показывает, что молекулярную основу устойчивости составляют изменения в основных парах, приводящие к аминокислотным замещениям в 10 различных положениях в белке (табл,2), имено остатки 121, 122, 197, 205, 256, 359, 384, 588, 591, 595,В шести из этих положений, а именно 122, 197,205,256,384 и 591(табл.2), получают более чем одно замещение, придающее гердицидную устойчивость. В положении 122 остаток аланина присутствует во всех известных знзимах АЛС дикого типа за исключением изознзйма Е.соП, в котором остаток 122 замещен на аспарагиновую кислоту, пролин, треонин или валин, что приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине. В положении 197, остаток пролина присутствует во всех известных знзимэх АЛС дикого типа за исключением изознзимов П и И Е,соИ, замещение серина или аргинина приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине. В положении 205, где остаток аланинэ присутствует во всех известных знзимах АЛС дикого типа, замена остатка в положении 205 на аспарагиновую кислоту или треонин прйводит к получению АЛС, устойчивой к сульфо. нилмочевине. В положении 256, где остаток лизина присутствует во всех известных знзимах АЛС дикого типа, замена остатка 255 на глутэминовую кислоту, аспарагин или треонин приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине, В положении 384, где аспарагиновая кислота присутствует во всех известных энзимах АЛС дикого типа, замена остатка 384 на глутаминовую кислоту, аспарагин или валин приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине. В положении 591, где триптофан15 к суд ьфонилмочевине, В положении 359, где 20 30 35 40 45 приводящие к замещениям лизина - остатка 50 55 5 10 присутствует во всех известных знзимах АЛС дикого типа, за исключением изознзима. 1 Е.со 1, в котором замена 591 остатка на аланин, цистеин, глицин,. лейцин, аргинин или серин приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине,Были получены мутанты, устойчивые к гербицидам на основе сульфонилмочевины, в результате отдельных аминокислотных замещений в других четырех положениях, а именно 121, 359, 588 и 595. В положении 121, где глицин присутствует во всех известных.знзимах АЛС, замещение его серином приводит к получению АЛС, устойчивой метионин присутствует во всех известных знзимэх АЛС, замещение его валином приводит к получение АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине. В положении 588, где валин присутствует во всех известных знзимах:АЛС, замещение его эланином приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине. В положении 595, где фенилаланин поисутствует во всех известных знзимахАЛС, за исключением изознзимаИ Е,со 11,. замещение его лейцином приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмоцевине.Олигонуклеотиднаправленные сайтспецифйческие мутации, приводящие к аминокислотным замещениям в положениях 122, 205, 256, 359, 384 и 591, выполнены в дрожжевом гене, кодирующем АЛС (табл.3), В положении 122 производят мутации,приводящие к замещениям аланина 18 аминокислотами, присутствующими в АЛС дикого типа. Каждое замещение за исключением глицина приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине. В положение 205 мутации, приводящие,к замещениям аланина - остатка дикого типа на цистеин, глутаминовую кислоту, аргинин или триптофан, образуют АЛС, устойчивую к сульфонилмочевине. В положении 256 мутации,дикого типа на аспарагиновую кислоту, глицин, лейцин, пролин или триптофан, образуют АЛС, устойчивую к сульфонилмочевине. В положении 384 мутации, приводящие к аминокислотным замещениям аспэрагиновой кислоты - остатка дикого типа на цистеин, глицин, пролин, лизин, серии или триптофан, образуют АЛС, устойчивую к сульфонилмочевине, В положении 591 мутации, приводящие к аминокислотным замещениям триптофана - остатка дикого типа на аспарагиновую кислоту. глутэминовую кислоту, фенилаланин, гистидин, изолейцин, лизин, эргинин, валин, метионин, аспарагин, глутамин, треонин или тирозин, 1820914 18образуют АЛС, устойчивую к сульфонилмочевине,Все мутации, описанные в табл,2 и 3,Е,соИ приводят к получению энзимов, которые активны и менее ингибируются гербицидами на основесульфонилмочевины, чемэнзимы дикого типа. Вместе взятые эти результаты показывают, что большинство замещений в этих 10 положениях приводит кполучению, ферментативно активной гербицидустойчивой АЛС;Аминокислотные остатки в положениях121, 122, 197, 205, 256, 359, 384, 588, 591 и595 во всех. растительных энзимах такие же,. которые присутствуют в гербицидчувствительном дрожжевом белке дикого типа, Оказалось, что две мутации генетически связаныи введение этого фрагмента в чувствительныеклетки табака придает клеткам такой же уровень гербицидной устойчивости,.который обнаружен для первоначального высокоустойчивого мутантного растения табака, откоторого происходит данный энзим. На основе этих фактов ожидается, что должныбыть два аминокислотных замещения в энзиме, кодируемом этим фрагментом, Сравнение выведенной аминокислотнойпоследовательности мутантной АЛС с выве. денной аминокислотной последовательностью АЛС дикого типа выявляет, чтомутантная АЛС имеет замещение пролинааланином в положении 197 и замещениетриптофана лейцином в положении 591. Наосновании изложенного обнаружено, чтозамещения в остатках пролина 197 и триптофана 591 придают гербицидную устойчивость. Сравнение выведенной аминокислотной последовательности мутантного энзима АЛС с аминокислотной последовательностью энзима.АЛС дикого типа выявляет,что мутантная АЛС имеет единственное замещение пролина глутамином в положении197. Линия клеток СЗ, из которой был полученген ЗОВА-СЗ, показывает избирательную гербицидную устойчивость. Это означает, что мутация СЗ придает устойчивость к сульфонилмочевинным гербицидам хлорсульфурон исульфоментуронметил, но не придает устойчивость к гербициду на основе имидазолинона.Идентификация аминокислотных замещений в гербицидустойчивых энзимах АЛСиз растений в положениях 197 (от мутантовСЗ и Нга) и 591 (от мутанта Нга) показывает,что замещения в положениях, операбельных в дрожжевой АЛС, также операбельныв растительной АЛС.В то время как аминокислотные остатки, присутствующие в положениях 121, 122;197, 205, 256. 359, 384, 588, 591 и 595, сохра винными гербицидами, чем растительная, или дрожжевая АЛС. Кроме того. сайт-на.правленная мутация, вызывающая замещение серина пролином в положении 197 в 20 Е.соИ,АЛС И, придает мутантному энзиму в 30 35 40 5 10 няются во всех гербицидчувствительных энзимах АЛСдикого типа,до сих пор имеющих отличительные признаки эукариотов, некоторые замещения.в этих положениях встречаются в бактериальных энзимах АЛС дикого типа, ИзоэнзимЕ,со имеет серин, а не аланин в положении 122, и глутамин, а не триптофан в положении 591; изоэнзим И Е.соП имеет серин, а не пролин в положении 197. а изоэнзим И Е,соИ имеет аланин, а не пролин в положении 197 и изолейцин, а не фенилаланин в положении 595. Каждый из этих изоэнзимов АЛС Е.со более устойчив (от 50 раздо болеечем 10000 раз) к ингибированию. (определенными) сульфонилмоче 100 раз большую чувствительность к ингибированию, т,е, такую чувствительность, которая присуща энзимам высших растений дикого типа. Таким образом, пролин в положении 197 вовлечен в гербицидное связывание в АЛС И Е.со так же. как и в АЛС дрожжей. и высших растений,Кроме того, были выполнены сайтнаправленные мутации, которые приводят к замещениям триптофана лейцином и глутамина триптофаном в положениц 591 в АЛС И и АЛСсоответственно, Мутация в АЛС И придает энзиму больше устойчивости к гербицидам, чем АЛ Сдикого типа, тогда как мутация в АЛСпридает ему больше чувствительности к гербициду, чем АЛСдикого типа. Сайтнаправленные мутации в положениях 197 и 591 в АЛСи АЛС П Е.соИ оказывают, воздействие на ингибирование мутантных энзимов гербицидом так, как можно зто предсказать из действия дрожжевых и растительных белков АЛС гербицидустойчивых мутантов, Эти экспериментальные данные подверждают универсальность аминокислотных остатков, вовлеченных в гербицидное связывание с энзимамиАЛС из разнообразных источников Аминокислотные замещения, необходимые для придания гербицидной устойчиво-, сти, получают путем сайтспецифического мутагена фрагмента нуклеиновых кислот, кодирующего гербицидчувствительную АЛС, следующим образом:(1) выделяют геномную ДНК или мРНК из растения;(2) конструируют геномную библиотеку из выделенной ДНК или кДНК-библиотеку из выделенной РНК;