Способ получения иммобилизованной люциферазы

"ОСУДАРСТЕННй КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ОПИСАНИ К АВТОРСКОМУ(71) Московский ордена Ленина, ордена Октябрьской Революции и ордена Трудового Красного Знамени государственный университетим. МВ. Ломоносова(54)(57) 1, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОИ ЛЮЦИФЕРАЗБ путем экстракции фермента.иэ лампочек светляков буферным раствором с последующей обработкой экстракта полисахаридным полимерным носителем, активированнмм бромцианом, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью увеличения удельной активности иююобилиэованного фермента и повышения степени извлечения активного фермента из экстракта, экстракцию осуществляют фосфатным буфером с ионной силой 0,5 М при весовом соотноше.нии ламйочки светляков : буфер 11:40-10, а обработку экстракта полимером проводят при весовом соотношении лампочки светляков ф полимер 1)1 3.2. Способ по п.1, о т л и ч а.ющ и,й с.я тем, что, в качестве полисахаридного носителя исполь эуют сефароэу, целлюлозу," целлофановую пленку, ультрагель и ультрадекс.ЗСпособ по п.1, о т л и ч а ю- щ и й с я тем, что, с целью экономии. Фермента, отработанный ферментный экстракт повторно используют для иммобилизации фермента.Известен способ иммобилизации люцифераэы светляков на аминированном стекле с помощью глутарового альдегида. Однако препараты иммобилизированной люциферазы, полученные этим способом, сохраняют только 0,07-0,16 исходной активности фермента.Йзвестен также способ получениями иммобилиэованной люцифераэы светляков, который заключается в следующем.Навеску обезноженных лампочек светляков экстрагируют при 4 Са 0,02 М трио-ацетатным буфером с 40 ионной силой 0,1-0,2 М, содержащим хлорид натрия и этилендиаминтетраацетат (ЭДТА). В ходе экстракции используют 100-кратный по весу избыток буФера по отношению к весу 45 лампочек светляков. Полученный экстракт обрабатывают 5-кратным по отношению к взятой навеске сырья избытком полимерного полисахаридного носителя, активированного бромцианом. В качестве носителя используют сефарозу или сефадекс. Получают препарат иммобилизованной люцифераэы светляков, сохраняющий 10-12 исходной активности с удель ной активностью 500-700 мВ/мг. Недостатком данного способа иммобилизации люциферазы является недостаточная удельная активность получаемого препарата и неполное извлечение активного Фермента из экстракта. При повторной -обработке надосадочной жидкости полимером процент извлечения Фермента крайне мал. По-видимому, оставшийся непро 65 Изобретение относится к биохимии,а именно к способу получения иимобилизованной люциферазы, в частности люциферазы светляков, Этот Фермент широко используется в лабораторной и медицинской практике для 5аналитического определения аденозин-трифосфата АТР ), Определение АТР служит для целей медицинской диагностики и для анализа загрязнений окружающей среды. В частности н медицине этот метод используют для ранней диагностики инфаркта миокарда, для определениячувствительности к антибиотикам.ит.п. Определение АТР в водоемах 35и в морской воде позволяет оценитьих биологическоую продуктивностьи наличие загрязнений. Растворимаялюцифераза отличается высокой лабильностью, что затрудняет ее использование на практике, Поэтому20разработка методов стабилизации люциферазы, в частности ее иммобилизации, приобретает важное практичес.кое значение,25 экстрагированным фермент быстро инактивируется в растворе в условиях,эксперимента,Целью изобретения является ловышение удельноей активности иммобилизованного фермента при увеличейии степени извлечения активного1 фермента иэ экстракта.Цель достигается при реализацииописываемого способа получения иммобилиэованной люцифераэы снетлякон,включающим экстракцию фермента иэлампочек светляков буферным раствором и последующую обработку полученного экстракта полимерным полисахаридным носителем, актинированнымбромцианом, причем экстракцию осуществляют Фосфатным бубером с ионной силой 0,5 М при весовом соотношении лампочки светляков:буфер1:40-10и обработку экстракта полимером проводят при весовом соотношении лампочки светляков:полимер1:1-3. Обычно в качестве полисахаридного носителя используют сефарозу, сефадекс, ультрагель (смешанный полимер, полиакриламида иагарозы ), ультрадекс (гель декстрана) целлофановую пленку, целлюлозу,С целью экономии Фермента отработанный Ферментный экстракт можноповторно использовать для иммобилизации Фермента, для экстракции используют 0,1 М фосфатный буФер,содержащий 0,2 М,БаС 1 и 2 мМ ЭДТА.Экспериментально показано, что замена трис-ацетатного буфера на фосфатный с большей ионной силой обеспечивает большую стабильность фермента.Способ осуществляют следующимобразом.Экстракт лампочек светляков н Фосфатном буфере встряхивают с активированным носителем при 4 С во течение 24 ч при укаэанном выше соотношении компонентов. Изменение ,весового соотношения лампочки светляков: полимер как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения приводит к уменьшению удельной активности получаемой иммобилизованной люциферазы. Надосадочную жидкость отделяют и снова встряхивают с полимером в тех же условиях.В результате такой обработки экстракта носителем получают препарат иммобилизованной люциферазы с удельной активностью 2000-5000 мВ/мг при сохранении 20-25 исходной активности люциферазы.П р и м е р 1, 300 мг тонко растертых .лампочек светляков экстрагируют 6 мл 0,1 М фосфатного буфера (0,2 М ИаС 1, 2 мм ЗДТЦ рН 8,0) в течение 40 мин при 4 фС. Полученную суспензию центрифугируют987976 Составитель О. СкородумцеваРедактор П. Горькова Техред М,Надь КорректорГ, Огар Заказ 1138/5 Тираж 522 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва ЖРаушская наб., д. 4/5.Филиал ППП "Патентф, г. Ужгород, ул. Проектяая, 4 15 . 000 об/мин, 10 мин, 5 С ) . Раствор отделяют, Полученный водный экстракт люциферазы обрабатывают 300 мг сефарозы, актнвированной ВгСЫ. Суспенэию встряхивают при 4 С в течение 24 ч . Полученный в результате полимер с ковалентно присоединенной люциферазой отделяют на стеклянном фильтре, Надосадочный раствор повторно обрабатывают 300 мг ВгСз-активированной сефарозы в тех же условиях, Оба последовательно полученные препараты иммобилизоваиной люциферазы имеют одинаковую удельную активность, 5000 мВ/мг. В результате сохраняется 20 исходной активности люциферазы.П р и м е р 2, 80 мг тонко растертых светляков экстрагируют 2 мя 0,1 М фосфатного буфера (0,2 И МаСХ;2 мМ ЭДНА рН 8,0). Надосадок отделяют и 2 .раза последовательно .обрабатывают порциями по 240 мг ВгСЯ-активированной сефароэы тем же способом, что и в примере 1.удельная активность обоих препаратов иммобилиэованной люциферазы 2000 мВ/мг при сохранении 25 исходной актив.ности люциферазы."П р и м е р 3. 500 мг тонко рас.тертых лампочек светляков экстрагируют 5 мл 0,1 И фосфатного буфера, 0,2 М МаС 1, 2 мМ ЭДТА РН 8,0. Надосадок отделяют и обрабатывают500 мг ВгСБ-актнвированной сефарозы тем же способом, что и в предыдущих пРимерах. Удельная активность 5полученного препарата 4000 мВ/мгпри сохранении 15% исходной активности люцифераэы.П р и м е р-.: 4. 400 мг тонкорастертых лампочек светляков экстрагируют 6 мл 0,1 И фосфатного буфера, 30 0,2 М БаС 1, 2 мИ ЭДТА, рН 8,0. Надосадок отделяют и добавляют к нему400 мг ВгСБ-активированного ультрадекса. Иммобилизацию проводят также, как и в предыдущих примерах.15 Удельная активность иввюбилиэованных на ультрадексе препаратов2500 мВ/мг при сохранении 20 исходной активности люциферазы.Предлагаемый способ иммобилизации 2 О позволяет получать препараты судельной активностью в 3-10 разбольше, чем с помощью известных методов. Процент извлечения активногофермента возрастает в 2-2,5 раза.25Применение стабильных и высоко.,активных препаратов иммобилизованной люцифераэы в анализе позволяетдобиться высокой точности и воспрс О иэводимости, упрощает методику; атакже приводит к уменьшению расходасамого фермента.