Способ получения агглютинина

(54) (57) СПОС ТИНИНА путем шей пшеницы, р той с антиокс очисткой фильт аффинный сорбе с целью повь родукта, очистк ма, в качест ауэкс, а в ента - иммоб Т 1 1 ие цп ргеаза д 1976 К. п ей у гт Д 58 б ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ К АВТОРСКОМУ СВИ(56) 1. Воайагд Р., Могоцй тРг 1 ча 1 .).-Р. Мопядпу М. Апве йод 1 ог рцгй салоп о 1 жйаддц 11 п 1 п 1 есбп. - В 1 осбепие1247 в 12 (прототип). ОБ ПОЛУЧЕНИЯ АГГЛЮ- экстракции муки из зародыазбавленной соляной кислоидантом, с последующей рацией через анионит и нт, отличающийся тем, что, щения выхода целевого у проводят в условиях вакуве анионита используют качестве аффи нного сорлизованный овомукоид.Изобретение относится к биологии, в цастности к получению биологицески активного гликопротеида из зародышей пшеницы отходов мукомольного производства.Сам целевой продукт может найти применение в научных исследованиях: в гемато. логии, иммунохимии, микробиологии и систе матике организмов, биохимии, физиологии и экологии, эмбриологии и гистохимии, онкологии и др. Перспективно применение агглютинина в медицине в качестве противосвертывающего средства и в конъюгированном с лекарствами виде, например при терапии опухолей, а также в качестве идентификатора патогенных микроорганизмов в свободном (окраска методом сэндвич) или флуоресцентно меченом виде.Известен способ получения АЗП, предусматривающий экстракцию муки из обезжиренных зародышей в разбавленной соляной кислоте с антиоксидантом, доведенйе рН среды твердым Трисом до 8,6 и очистку агглютинина фильтрацией экстракта через а мберлит 1 КАс последующей хроматографией на р-аминофенил-тио- - а цета м ид,2-дидезок с и-у- Э- гл юк о и ир а н оз иде, иммобилизованном на ультрагеле А 4 1.Однако этот способ не обеспечивает высокого выхода агглютинина (500 мг агглютинина из 1 кг необезжиренных зародышей пшеницы).Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения агглюти нина путем экстракции муки из зародышей пшеницы, разбавленной соляной кислотой с антиоксидантом, с последующей очисткой фильтрацией через анионит и аффинный сорбент очистку проводят в условиях вакуума, в качестве анионита используют Дауэкс, а в качестве аффинного сорбента - иммобилизованный овомукоид.Способ осуществляют следующим образом.Свежие зародыши пшеницы обезжиривают петролейным эфиром или гексаном.Затем обезжиренные зародыши измельчают в мельнице ударного типа и экстрагируют раствором соляной кислоты с антиоксидантом при постоянном перемешивании. Затем доводят рН смеси до 8,6 и центрифугируют. Недостаточную жидкость последовательно фильтруют в условиях вакуума через колонку с анионитом Дауэкси иммобилизованный на агарозе овомукоид. Связавшийся с иммобилизованным овомукоидом агглютинин отмывают от примесей и проводят снятие агглютинина с сорбента, диализ полученного раствора против дистиллированной воды и лиофилизацию раствора очищенного агглютинина.Пример. Свежие зародыши пшеницы (полученные на 1 - 14-е сут после помола зерна с Раменского Мукомольного комбината15 20 2Московской области) сразу обезжиривали. Для этого 1 кг сырья заливали 3 л петролейного эфира при комнатной температуре и 10 мин смесь перемешивали, после цего эфир удаляли с помощью вакуумного отсоса на воронке Бюхнера (вакуум создавался водоструйным отсосом и не превышал 1 атм). Обработку зародышей эфиром повторяли еще 2 раза, высушивали в воздушной струе в вытяжном шкафе, периодически перемешивая сырье.Выход по весу составлял 90 Я. Хранили при 4 С в герметическом сосуде.Все последующие операци и выпол няли при 4 С. 100 г обезжиренных зародышей измельчали в мельнице ударного типа и добавляли при перемешивании к 600 мл 0,05 н. НС 1 с 1 мм метабисульфитом натрия Ма,ЬОь. Перемешивание продолжали ночь (без образования пены), надосадочную жидкость после ,центрифугирования смеси при 5000 хд 30 мин доводили при овомукоидом агглютинин отмывали от примесей последовательным пропусканием через сорбент по 250 мл следующих растворов: 0,05 М Трис-НС буфер рН 8,6; 1 М Ха С 1;0,05 М Ма -ацетатный буфер рН 4,4. Оптическая плотность последних порций элюатов из сорбента не превышала при 280 нм 0,03 для каждого из промывных, растворов. Снятие аглютинина с сорбента проводили 005 н, НС 1 рН 16 и контролировали спектрофотометрически. Раствор агглютинина нейтрализовали 1 М щелочью и диализовали ночь против дистиллированной воды (1:100, по объему). Выпавший 50 55 перемеши ванин кристаллицеским измельченным Тряс- (оксиметил) -аминометаном до рН 8,6. После центрифугирования смеси при 5000 Х д 60 мин надосадоцную жидкость фильтровали через предварительно уравновешенную 0,05 М Трис-НС 1 буфером рН 8,6 колонку с 300 г сильного анионита на стирольной основе со степенью анионита ных сшивок частиц 2, размером шариков 37 - 149 мкм с функциональными группами С 6 НьСНМ+(СНз) з в ОН:форме (дауэкс, 100 - 400 меш. Серва). Фильтрование проводили на стеклянном фильтре Мо 2 с применением вакуума, создаваемого водо- струйным отсосом. Фильтрат сразу пропускали через предва рительно уравновешенный 0,05 М Трис-НС 1 буфером рН 8,6 иммобиЗ 5лизованный на агарозе овомукоид из белка куриных ииц. Объем сорбента составлял 50 мл осевшего геля и содержал 55 мг активного по трипсину овомукоида (исходно для пришивания к этому количествуагарозы 40 50 мл с помощью Вг Хактивированиябрали 200 Мг очигценного на трипсине иммобилизованного овомукоида). Фильтрацию экстракта через иммобилизованный овомукоид осуществляли на стеклянном фильтре Мо 3 с помощью вакуумного от соса. Связавшийся с иммобилизованным1 61111 Выход целевогопродукта из 1 кгсырья, мг Время хранения обезжиренных зародышей пшеницы,сут 603(585)"600(585)600(583)"598(583) 60 360 20 720 Составитель Л. АртюшинаТехред И. Верес Корректор М. СамборскаяТираж 722 ПодписноеВНИИ ПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Редактор Н. Швыдкая Заказ 3879/9 балластный материал углеводного происхождения удаляли из диализа центрифугированием при 5000 Кд 30 мин, а надосадочную жидкость с очищенным агглютинином лиофилизировали на сублимационной сушке КС. Таким образом, из 100 г обезжиренных зародышей (т. е, из 117 г необезжиренных зародышей) получали 65 г гомогенного, не содержащего солей лиофилизированного порошка агглютинина, с выходом 585 мг агглютинина из 1 кг не- обезжиренных зародышей. Рассчитанное в растворе после иммобилизованного овомукоида содержание агглютинина по характерной для него оптической плотности при 280 нм равной 15 (1 о-ный раствор агглютинина) совпадало с весом лиофилизированного агглютинина.Выход целевого продукта по предлагаемому способу составил 580 - 603 мг на 1 кг необезжиренных зародышей пшеницы, а по способу-прототипу - в среднем 500 мг на 1 кг необезжиренных зародышей. Таким образом, предложенный способ позволяет повысить выход агглютинина на 10 -4%.Кроме того, применение вакуума на стадиях.обезжиривания и фильтрации через последовательно соединенные колонки с сильным анионитом и афинным сорбентом позволяет сократить время осуществления способа с 50 (по прототипу) до 24 ч (по предлагаемому способу).Кроме того, обезжиренные зародыши пшеницы могут храниться более 1 года без заметного снижения выхода целевогопродукт а.В таблице приведены данные влияниявремени хранения зародышей пшеницы навыхода целевого продукта (обезжириванне5проводили через 1 или 14 сут). Обезжиривание через 14 сут. 25 Предлагаемый способ получения агглютинин а из зародышей пшеницы доста точ но прост, используются доступные сорбенты, а в качестве источника сырья - отходы мукомольного производства, что может способствовать созданию безотходной техно- ЗО логии в мукомольной промышленности.