Способ получения диагностической псевдотуберкулезной сыворотки

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик ь 889003(22)Заявлено 01.06.79 (21) 2773922/28-13с присоединением заявки ййОпубликовано 15. 12.81, Бюллетень РВ 46Дата опубликования описания 18. 12.81 иа делаи изабретеиий и открытий(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗНОЙ СЫВОРОТКИ Изобретение относится к микробиологии и касается получения диагностических препаратов.Известен способ получения диагностической псевдотуберкулезной сыворотки путем выращивания псевдотуберкулезных микробов на питательной средес последующей иммунизацией животныхпродуцентов; и отделением сывороткикрови 1.Однако известный способ не обеспечивает. получения сыворотки с высокой специфичностью,Целью изобретения является повышение специфичности сыворотки.Эта цель достигается тем, что спо соб получения диагностической псевдо- туберкулезной сыворотки осуществляют ,путем выращивания псевдотуберкулез, ных микробов на питательной среде с последующей иммунизацией животныхпродуцентов и отделением сыворотки крови, псевдотуберкулеэный микроб . выращивают при 10-12 С, выделяют спе- о цифический поверхностный антиген ииммунизацию проводят однократно в дозе 0,1-0,15 мл с содержанием белка100 мкг/мл Физиологического раствора,Согласно предлагаемому способу по.лучения псевдотуберкулезных сывороток для иммунизации используют высокоспецифический поверхностный антиген, полученный иэ микробной клетки тощ,-щ а,У. рэеидоСыЬегсц 1 оеэ без нарушенияего природной структуры. Выделенныйкомплекс является сильным антигенным раздражителем, способным даже приоднократной иммунизации вызывать гипериммунный ответ макроорганизма.Для иммунизации кроликов выделяют поверхностную субстанцию псевдотуберкулезного микроба наиболее щадящим 20способом - механической дезинтегра"цией, что обеспечивает сохранениевещества в нативной форме. Далее изповерхностной субстанции осаждаютвысокомолекулярную Фракцию центрифу 3 88900гированием при 35000 д. Эту фракциюзатем перерастворяют в небольшомобъеме низкомолекулярной фракции (супернатанте). Иммунизация кроликовсмесью этих фракций с превалировани 5ем высокомолекулярного компонентаобеспечивает острый иммунный ответживотных.Для иммунизации кроликов исполь"эуют антиген в низких концентрацияхпо белку (10-15 мкг) для одноразового внутривенного введения вещества.Антиген, взятый в дозе менее 10 мкг,гуморэльного ответа не вызывает, .Использование же антигена в дозе, превышающей 15 мкг, вызывает иммунологический паралич. Для получения специфических диагностических псевдотуберкулезных сывороток оптимальнойдозой вводимого препарата является10-15 мкг в 0;1 мл Физиологическогораствора,П р и м е р. Материалом для иммунизации кроликов служит комплекс поверхностных антигенов псевдотуберкулезного микроба. Чтобы получить егокультуру микроба выращивают в течение 2-3 суток на мясо-пептонном агаоре при 10-12 С, что позволяет сохранить микроорганизмы в 5-Форме (в стабильном состоянии), Затем культурусмывают Физиологическим раствором сФосфатным буфером (рН 7,2-7,4),центрифугируют при 5500-6000 д об/минв течение 30 мин и двукратно отмывают этим же раствором, центрифуги 35руют культуру по 30 мин. Надосадочнуюжидкость удаляют, Осадок ресуспендируют до концентрации 2 1 О в физиологическом растворе с фосфатным буфе 4 Ором (рН 7,2-7,4), а поверхностныйантиген отделяют на механическом дезинтеграторе в течение 15 мин, дающий 3000 колебаний в минуту, Послеотделения поверхностной субстанции4бактерии осаждают центрифугированиемпри 6000 об/мин в течение 30 мин иудаляют, Суспернатант консервируютмертиолатом натрия (1;5000-1:10000,экспозиция 1 ч при 4 С) и вновь центрифугируат при 9000 об/мин (для уда 56ления единичных бактерий), Осадокудаляют, а супернатант центрифугируют при 37000 д в течение 2-х часовпри 4 С. Полученный осадок (высокомолекулярную фракцию поверхностногоИантигена) перерастворяют в минимальном количестве (1/5 часть) суспернанта (низкомолекулярная Фракция),3 4определяют количество белка по Лоурии разводят до концентрации 100 мкгбелка в 1 мл физиологическим раствором,Схема иммунизации животных. Кроликов весом 2,5-3 кг однократно иммунизируот внутривенно в краевую ушную вену в дозе 0,1 мл (10-15 мкгбелка) препарата, растворенного в0,1 мл физиологического раствора.Через 8 дней проводят пробное взятиекрови и определяют титр гемагглютининов, Б зависимости от индивидуальной чувствительности животных титры антител колеблются в пределах1/6400-1/51300. Для иммунизации животных используют антиген приготовленный согласно предлагаемому способу, который разводят физиологическим раствором до концентрации 100 мкгбелка, определенного методом Лоури.После установления титра антител животных обескровливают, отделяют сыворотку, лиофильно сушат и хранятв холодильнике при 4 С, Срок хранеания (срок наблюдения) более года,Специфичность сывороток проверилив реакции непрямой гемагглютинации счумным антигенным диагностикумом ив реакции агглютинации с живыми культурами 5. епйег 111 д 5, 5. рагайурЬ 1 Е, Е, со 1 0-124, с вакцинным штаммом чумного микроба (ЕЧ) и диагностикумом брюшного тифа,Сыворотки, приготовленные по известному способу, давали положительные РНГА и РЯ с чумным эритроцитарным антигенным диагностикумом и вакцинным штаммом чумного микроба (ЕУ)в разведении 1:50. Сыворотки,приготовленные предложенным способом, имеют положительные РНГА и РА с указанными диагностикумами в разведениях1;40 и 1:20 соответственно. С остальными культурами реакции оказались отрицательными,Полученные диагностические превдотуберкулезные сыворотки обладают догстаточной чувствительностью, высокойспецифичностью, имеют высокую концентрацию антител и найдут широкоеприменение в баклабораториях санэпид"станций с целью диагностики псевдотуберкулеза и установления серологической принадлежности возбудителя заболевания. Сроки получения этих сывороток в 2 раза короче известного ранее способа, что экономически болеевыгодно.Тираж б 90 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, )(-35, Раушская наб., д, 4/5 Заказ 10801/9 филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная,Способ получения диагностической псевдотуберкулезной сыворотки путем выращивания псевдотуберкулезных микробов на питательной среде с последующей иммунизацией животных-продуцентов и отделением сыворотки крови, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения специфичности сыворотки, псевдотуберкулезный микроб 3 1выращивают при 10-12 ОС, выделяют специфический поверхностный антиген и иммунизацию проводят однократно в дозе 0,1-0,15 мл с содержанием белка 100 мкг/мл физиологического раствора. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе 1. Королюк А.М. Серологическая диагностика псевдотуберкулеза. Канд. дис, Л., 1971.