Способ выявления вторичных мутагенов

3 " 1510366 4 перимента 5 О мл ночной культуры пе-Число ревертантов определяют пуреносят в 100 мп мясо-пептонного буль- тем перемножения среднего числа ко" она и подращивают при 37 С до плот- лоний на чашках на четыре и получают ности 510 ф клеток при постоянном 5 число мутантов в 1 мп. Расчет часто- встряхивании, Содержимое колбы пе- ты мутаций производят путем деления реносят в стерильные центрифужные числа мутантов в 1 мл число выживших пробирки и центрифугируют на центри- клеток. Статистическую обработку фуге,Кпри 4 С при 5000 об/мин . полученных данных проводят по крите- в течение 20 мии. Осадок суспенди рию Стьюдента. руют в 30 мл минимальной среды, раз- П Р и м е р 1. Эксперимент про" веденной в четыре раза, Центрифуги- водят на трех , группах крыс линии рование повторяют и том же режиме, ВАГ. Первую группу крыс содержат Осадок ресуспеидируют в 15 мл 0,15 Х на общевиварном рационе. Вторая груп- хлористого кайия. 15 па животных получает сбалансированВ инкубационную смесь, содержа- ную полусинтетическую диету (табл.1).1 цую 0,7 мл бактериальной суспензия, Третью группу животных содержат на 0,1 раствора хлористого магния (160 иИ) диете с деФицитом лизина, треонина, 0,2 мл 0,5 пИ раствора НАЛФН, О,З мл метионина и витаминов А, С и Е суспензии микросом добавляют в слу (табл,2).чае контрольных вариантов 0,2 мл Состав солевой смеси полусинтетидистнллированиой воды, а в опытные ческих диет приведен в табл. 3. Соо варианты либо 0,2 мл И-нитрозомор- тав витаминов - в табл. 4. В диету ящ- фолина до конечной концентрации вотных третьей группы витамины А С 200 мкг/мл, либо 0,2 мл циклофосфа и Е не вводят. на до конечной концентрации 500 мкг/мл, животных содержат на вышеуказанных Инкубационную смесь выдерживают на рационах в течение 1,5-2 месяцев. В водяной бане при 37 С в течение ЗОмин течение трех дней перед забоем все йри постоянном встряхивании. Реак- группы экспериментальных животных поцию останавливают добавлением 2,0 мл 30 лучают внутрибрющинно. инъекции фехолодного 0,15 Мраствора хлористого нобарбитала в дозе 80 мг/кг массы калия. Затем инкубационную смесь цент- тела, Выделение препарата микросом рифугируют прн 5000 обмин в тече- Печени крыс проводят общепринятым ние 10 мин. Осадок суспеидируют в методом.1,5 мл минимальной жидкой среды, раз Данные по мутагенной метаболичеведенйЬй в четыре раза, ской активации Ю-нитрозомарфолина иДля определения количества выжив- , циклофосфана, при описанных выше зксших бактерий 0,5 мл суспензия разно- периментальных условиях, приведены дят до 10и 0,5 мл разведенной сус" в табл. 5 и 6 соответственно, пензии вносят в чашки с мясо-пептон Как видно из табл.в частота инным агаром и подращивают в термостате дуцироваиных мутаций вследствие мепри 37,С в течение 18 ч, таболической активации И-ннтрозоморДля учета количества ревертантов фолина выше при использовании био,25 мл цельной суспензии переносят в материала животных, содержащихся напробирки с О,бй-ным минимальным ага- ф 5 диете с дефицитом лизина, треонина,Фром (предварительно расплавленным при метионина и витаминов А,С и Е, по100 С), перемешивают. Содержимоесравнению с другими группами животпробирки разливают на чашки. Петри с ных. Так, крличество индуцироваиных1,57-ным минимальным агаром и инкуби- мутаций с биоматерналомтретьей группыруют в термостате прн 37 С в течение 50 животных увеличивается в 1,5-6 раз 48 ч., по.сравнению с остальными групйами,Для учета выживших бактерий под- Такая же направленность возрастасчитывают количество колоний на чаш- иия частоты индуцированных мутацийках, среднее умножают на два и опре" набюдалась при использовании в каче,деляют число жизнеспособных клеток 55 стве тестируемого вторичного.мутагенав 1 мп при данном разведении. Путем . циклофосфана (табл.б). Как видно из, перемножения этой величины на козф- таблицы,.количество мутаций при ис"1фициент разведения получают чиспо жнз- пользовании биоматериала животныхнеспособных, клеток в исходном варианте. третьей группы достоверно увеличи- о5 15валось в 1,5-2 раза по сравнению саругими группами животных. 10366 Таким образом, приведенные выше результаты показывают, что при условии использования биоматериала от животньж, содержавшихся на диете с дефицитом лизина, треонина, метионина и витаминов А,С и Е, обеспечивается достоверное повышение чувствительности способа.Формула изобретенияСпособ выявления вторичных мутагенов путем иик бадин исследуемого УТаблица 1Состав (г/100 г) и калорийность сбалансированнойполусинтетической диеты Содержание, г Количество Продукты Калорийность белки жиры углеводы г 62,22186,16 14,62 0,25 0,5 45,04 69,84 29,28 21,73 7,50 0,67 2,53 1,48 5,30 369,23100,0 51,82 58,51 17,65 9,93 8;42 21,56Таблица 2 Состав (г(100 г) и калорийность диеты с дефицитомлизина, треонина, метионинаф и витаминов А,Е, С Продукты Количество,Содержание, г Калорийность белки жиры углеводы 0,9 86,1 Казеи 2,580,5045,04 50,4 КрахмалМасло подсолнечноерафинированноеКлейковинаОтруби пшеничныеСахароза 69,8450,8729,28 .21, 73 5 ,1 ,6 7,8 14,0 16,0 5;6 3,0 2,41 2,53 1,4 5,3 Солевая смесьВитаминная смесВсегоКалорийность,й 51,82 58,44 18,368,86100,0 10002 8,3 32 21,2 Ф - Амино ислотный дисбал клейковину.нс достигался путем замены каэеина на и ннчную щ- Витам диетыделировалась исключени э состава аточност ЕиС. иная недовитаминов Каэеин 17,0 Крахмал 50,4 Масло подсолнечное рафинированное 7,8 Отруби пшеничные 16,0 Сахароза 5,6 Солевая смесь , 3,0 Витаминная смесь 0,2 Всего 100 Калорийность, Х вещества с микросомами печени в присутствии бактериальных клеток, отде-ления бактериальных клеток, посева их на селективиую среду и регистрации числа колоний мутантных клеток в сравнении с контролем, о т л и - ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, 10 используют микросомы, выделенные изпечени животных, содержащихся на диете, дефицитной по незаменимым аминокисло"гтам: лизину, треонину, метионину н витаминам А,С и Е не менее 1,5 меся цев.1510366 Т аблица Э Состав солевой смеси (мг/1 ООг) Хлористый калийФосфорнокислый калийХлористый натрийУглекислый цинкХлористый кобальтМолибденовокислый аммонийУглекислый магнийСеленит натрия Таблица 4 Состав витаминов (мг/.00 г) Витамин А Витамин К Витамин С Витамин О Инозитол кальцияБиотин 0,01 фолневвя кислота 0,2 100,0,0 8,5 Холин хлорндВикасолНиацин (витаминРР) Таблица 5 Иутагенная метаболнческвя активация И-ннтрозоморфолнна микро- сомами печени крыс, содержавшихся на различных диетах и индуцнрованных фенобарбвталом в дозе 80 мг/кг в течение трех дней1 за 1 ООЕ принят уровень мутагенной активации Н-нитрозоморФолина при использовании микросом цеченн крЬс, содержавшихся,на общевиварном рационе) Частота мутаций 10, Х МПитание Общевивврный рационСбалансированная полусинтетическая диетаДеФицит лизина, треоннна,метнонина и витаминов А,С н Е 9,0+1,4 29,7+5,0 100 156 Р ъ 0,05 1 2, 68114,6 595 Р с 0,001 Т а б л и ц а 6Иутагенная метаболическвя: активация циклофосфана микросомами печени крыс, содержавшихсяна различных диетах ииндуцнрованных фенобарбнталом в дозе 80 мг/кг в течениетрех дней (за 1 ООХ принят уровень мутагенной активациициклофосфвнв при использовании микросом печени крыс,содержавшихся нв общевиварном рационе) Частота мутаций 10 , йШ Питание 43,4+2,7 666 й 1 е 9 Общевивврный рационСбалансированная диетаДефицит лизина, треонина,метионина и витаминов А,С н Е 100153 - Р с 0,001 229 ,Р с 0,001 99,6+6,1 Сернокислая медьСернокислое железоСернокислый марганецАлюмокалиевые квасцыИодистый калийФтористый натрийУглекислый кальцийФасфорнокислый кальций 5,00,01 ОО,О