Способ получения высокомолекулярных полинуклеотидов

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИ ИТИЛЬСТВУ нв 744004 Союз СоеетскихСоциалистическихРеспублик(51)М, Кд,2 ,С 07 Н 21/00 ф Ъ 61 К 31/70 с присоединением заявки Мо Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЬИ ПОЛИНУКЛЕОТИДОВИзобретение относится к усовершенствованному способу Получения высокомолекулярных полинуклеотидов, широко применяемых в генетике и ме-. дицине.Известен способ получения высокомолекулярных полинуклеотидов, заключающийся в реакции полнмериэациинуклеоэид-дифосфатов полинукле" 10 отидфосфорилаэой при температуре 30- 37 С и рН 8,0-8,1,отделении белка добавлением Фенола, осаждении смеси полинуклеотндов спиртом и в последующем разделении полученной смеси гель-Фильтрацией на сефадексе 6-100 на целевой продукт и низкомолекулярную фракцию. Выход полинуклеотидов 55, Состав полинуклеотидной Фракции 80 высокомолекулярных полинуклеоти дов, 20 ниэкомолекулярных полинуклеотидов (1."Известный способ имеет следующие недостатки;сравнительно низкий выход высоко молекулярной полинуклеотидной Фрак" ции, что составляет 80 из всех полученных полинуклеотидов;высокий расход дорогостоящего и дефицитного сырья, так как непро реагировавшие рибонуклеМид-диФосфаты и низкомолекулярные 1 полинуклеотнды (20 от полученных полинуклеотндов) далее неиспользуются.Целью изобретения является увеличение выхода высокомолекулярных полинуклеотидов и упрощение процесса.Поставленная цель достигается тем что полученную после осаждения спиртом смесь полинуклеотидов предварительно освобождают от низкомолекулярных примесей ультрафильтрацией н последующее разделение гель-Фильтрацией осуществляют на геле ЕД, что. позволяет улучшить разделение полинуклеотидной смеси, увеличить выход высокомолекулярных соединений на 15 и повторно рспользовать выделенные нуклеозид-дифосфат и ниэкомолекулярные полинуклеотиды.Предлагаемый способ получения высокомолекулярных полинуклеотидов заключается в реакции полимеризации нуклеозид-дифосфатов полинуклеотидфосфорилаэой при температуре 30- 37, С и рН 8,0-8,1, в отделении белка органическим,реагентом, предпочтительно смесью,хлороФорма и изоамило744004 вого спирта в соотношении 2,5:1, воеаждении смеси полинуклеотидовспиртом, в предварительном освобождении полученной после осаждения спир- .том смеси от ниэкомолекулярных примесей ультрафильтрацией и в последующем разделении гельфильтрацией на геле ЕД,Выход полинуклеотидной фракции55%.Состав полинуклеотидной фракции:95% высокомолекулярных полннуклеотидов, 5 низкомолекулярных полинуклеОтадов.Непрореагировавшие нуклеозид-дифосфат и ниэкомолекулярные поли-.нуклеотиды возвращаются в процессебиосинтеза.П р и м е р 1, 100 мг натриевойсоли аденозин-дифосфата раство-ряют в 1,0 мм 1 М трис-НСВ буфера,рН 8,0, прибавляют 1,0 мл 0,05 Мраствора ацетата магния и 3-5 мл фермента (в зависимости от активности,иэ расчета 5-6 ед активности на100 мкм И субстрата) . Добавляют дистиллированной воды до 10 мл и смесьинкубируют в термостате при 37 ОС.Через каждый час отбирают пробу по0,2 мл для определения неорганического Фосфора, выделенного в реакции,Реакцию останавливают выдерживаниемсмеси при 100 фС 3-5 мин, когда наступает значительное снижение скорости выделения ортофосфата. Выпавшийосадок отцентрифугируют 10 мин при2500 об/мин и +4 фС и отбрасывают. Кцентрифугату добавляют 2,5 мл хлороформа и 1,0 мл изоамилового спиртаи 15 мл встряхивают. Полученную смесьцентрифугируют 30 мин при 6000 об/мини +4 С. Полиадениловую кислоту (поли-А) высаживают из водного слоядвухкратным объемом этилового спиртас кристалликами хлористого натрия.Полученный осадок растворяют в дистиллированной воде. Для освобожденияраствора от низкомолекулярных примесей раствор пропускают через ультрафильтрат (размеры пор 5000-10000 Х),Получают две фракции: низкомолекулярную и высокомолекулярную,Высокомолекулярную фракцию пропускают через колонку с гелем ЕД(размеры колонки 602). Получаютполи-А с мол.весом 70000"100000. Выход 49 мг.Ниэкомолекулярные нуклеотиды (5)используют вновь для синтеза полинуклеотидов. Низкомолекулярную фрак"цйю проЩсвйот через колонку с гелем ЕД(размеры колонки 60 ю 2). Получают непрореагировавший аденоэин-5-дифосфатмг. Колонки проьывают и злюируют с 0,1 М растворомхлористого натрия. Препарат выпаривают и сушат на ротационном выпарите.ле. формула изобретения 1. Способ получения высокомолекулярных полинуклеотидов путем реакции 65 полимериэации нуклеоэид-дифосфа/ Аденоэин-дифосфат используютвновь для синтеза полинуклеотидов.Выход 55, (Состав полинуклеотйд"ной Фракции: 95 высокомолекулярныхи 5 ниэкомолекулярных нуклеотидов) .П р и м е р, 2. 125 мл натриевойсоли уридина-дифосфата растворяют.в 1,0 мл 1 М трис-НСЮ буфера(рН 8,0),прибавляют 1,0 мл 0,05 М раствора ацетата магния и 3,5 мл раствора Фермен-:та (в зависимости от активности израсчета 15-20 ед, активности на100 мкм М субстрата) . Добавляют дистиллированную воду до 10 мл и смесьинкубируют в термостате при 37 С. Через каждый час отбирают пробу по0,2 мл 40-ного раствора трихлоруксусной кислоты для определения неорганического фосфата, выделенного в реакции. Реакцию останавливают выдерживанием смеси при 100 фС 3-5 мин, когда20 наступает значительное снижение скорости выделения ортофосфата,В реакции выпавший осадок отцентрйфугируют 10 мин при 2500 об/мин и4 С и отбрасйвают, К центрифугату добавляют 2,5 мл хлороформа и 1,0 млиэ амилового спирта н встряхивают30 мин прн 6000 об/мин и 4 С. Полиадениловую кислоту высаживают иэ вод ного слоя двухкратными объемами этилового спирта и кристалликами хлористого натрияПолученный осадок растворяют в дистиллированной воде. Получают поли-Ас мол.весом 100000.Для освобождения раствора от ниэкомолекулярных примесей раствор пропускают .через ультрафильтрат (разме-,ры пор, 5000"10000 А), Получают двеФракции: низкомолекулярную и высокомолекулярную40 Высокомолекулярную фракцию пропускают через колонку с гелем ЕД(5) используют вновь для синтезаполинуклеотидов. НиэкомолекулярнуюФракцию пропускают через колонку сгелем ЕД(размеры колонки 602),щ , Получают непрореегируюший уридин-дифосфат, 40 мг. Колонки промывают и элюируют 0,1 М раствором хлористого натрия. Раствор выпариваюти сушат на ротационном выпарнтеле,Аденозин-дифосфат используютвнбвь для синтеза полинуклеотидов,Выход 55 (состав полинуклеотидной фракции: 95 высокомолекулярныхи 5 ниэкомолекулярных нуклеотидов).744004 Составитель Л, НикулинаРедактор Т. Никольская Техред М. Петко Корректор М. Демчик Тираж 495 Подписиое ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по.делам изобретений и открытий. 113035, Москва,. Ж, Раушская наб., д. 4/5Заказ 3642/1 филиал ППППатент 1 ф, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 тов полинуклеотидфосфорилазой притемпературе 30-37 ДС и рН 8,0-8,1,отделения белка добавлением органического реагента, .осаждения смеси полинуклеотидов спиртом и последующегоразделения полученной смеси гельфильтрацией, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью увеличения выходацелевого продукта и упрощения процесса, полученную после осаждения спиртом смесьпредварительно освобождаютот. низкомолекулярных примесей ультрафильтрацией и последующее разделе"ние гельфильтрацией осуществляют на,геле ЕД. 2. Способ по п, 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве органического реагента для осаждения белка используют;смесь хлороформа и изо-. амилового спирта в соотношении 2,5:1,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. 3, ЯССЕ цпй И, Нецвапп А ргосейцге аког Юе ргойцс 11 оп оК Еопдспа 1 пей роЕупцсЕеоСХйез цз 1 пд;роЕупцсЕео 1 йе рЬозрЬогуЕазе агою МХсгоссцз 1 узойе 1 с 11 аез, Ас 1 а В 1 оЕ.МеоЕ Сег. 14 (2 108-113, 1965 (прототип) .