Способ фракционирования нуклеиновых кислот бактерий

Союз Советскнк Социалистических Республик(21) 2125187/28-3 3 (5ки Но05.80. Бюллетень Ко 17 ением зая исо осударственный комите СССР по делам иэобретеннй и открытийописания 000580 2) Авторыизобретения А.И, Коротяев и Т,П. Кроличен 1) Заявител убанский медицинский институт имени Красной(54) СПОСОБ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ НУКЛЕИНОВ КИСЛОТ БАКТЕРИЙой Изобретение относится к биохимии,точнее к способу фракционированиянуклеиновых кислот бактерий для болееполного и точного учитывания количест-венного содержания дезоксирибонуклеиновой (ДНК) и рибонуклеиновой (РНК)кислот бактерий,Известен способ фракционированиянуклеиновых кислот бактерий, предусматривающий удаление свободных нуклеотидов и липидов иэ клеток бактерийт щелочной гидролиз.клеток и клеточйой РНК, осаждение ДНК и белкОвиэ гидролизата, отделение надосадочной жидкости, содержащей рибонуклеотиды от осадка 11) .Однако этот способ - классическийметод,Шмидта-Тайнхаузера не может,обеспечить полного и надежного разделения ДНК и РНК, и, следовательноне может быть использован для определения содержания ДНК у бактерий,так как он приводит к резкому занижению ее содержания, в то время какрезультаты определения количестваРНК эавьпаены,Целью изобретения является болееполное и точное разделение нуклеиновых кислот на фракции,Поставленная цель достигается тем, что надосадочную жидкость делят на две равные части, одну иэ которых обрабатывают этанолом для осаждения к ДНК, и осадок гидролизуют кислотой, после чего проводят количественное определение в полученных гидрэлизатах суммарной клеточной ДНК, а другую часть надосадочной жидкости гидролизуют и в полученном гидролизате определяют количественное содержание РНК.Сущность способа заключается в следующем.Определенную порцию фракции РНК нейтрализуют. концентрированным БаОН до рН 7,0, добавляют двойной объем холодного этанола (96 ) и выдержи- важа 1 ч при -6 С. Центрифугируют при 2-4 оС в течение 1 ч при 8000 об/мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок, содержащий ДНК, подвергают кислотному гидролиэу. В полученном гидролиэате определяют количественное содержание ДНК, Общее содержание ДНК у бактерий определяется как сумма ДНК, полученнсй после щелочного гидролиэа, и ДНК, осажденн этанолом из фракЦии РНК.Для доказательства, что осаждаемый этанолом из фракции РНК осадоксодержит действительно ДНК, используют три независимых метода: спектрофотометрический, колориметрический и метод обработки специфическими нуклеазами.Спектрофотометрические исследования показали, что полученный осадокимеет характерный для нуклеиновыхкислот Уф-спектр поглощения с мак 10симумом при 260 нм.Полученный осадок дает резко положительную реакцию с дифениламином,который специфически реагирует сдезоксирибозой.Обработка осадка ДНК-азой приводитк резкому изменению седиментационных пиков, получаемых при аналитическом центрифугировании, в то время как обработка РНК-азой характерапиков на седиментограмме практически не изменяет.Специально проведенные исследования с использованием дифениламиновой реакции показывают, что количество ДНК, не поддающееся осаждению этанолом и остающееся во фракции РНК, не превышает 10-12.П р и м е р , Культуру Е соЬ Мвыращивают на мясо-пептонном бульоне в течение 20 ч, 25 мл бульоннойкультуры переносят в центрифужнуюпробирку и центрифугируют при 2 ОСв течение 15 мин при 3000 об/миндля осаждения клеток. Надосадочнуюжидкость отбрасывают. Для удаленияостатков питательной среды осадокклеток ресуспендируют в 15-20 мл,0,15 М ИаС 1, центрифугируют при2 С в течение 15 мин при 3000 об/мин,Эту процедуру повторяют дважды,после чего удаляют кислоторастворимые нуклеотиды (строго при 2-4 С) .Отмытые от питательной среды клетки ресуспендируют в 10.мл холодной3-ной (НС 1 04, суспензию выдерживают 15 мин, центрифугируют 15 минпри 3000 об/мин, Надосадочную жидост сливают.Процедуру повторяют до полногоудаления кислоторастворимых нуклеоти.дов. Степень удаления нуклеотидовконтрОлируют путем спектрофотометрирования надосадочной жидкости при260 нм. Отсутствие поглощения свидете 7 ьствует о полном удалении кислоторастворимых нуклеотидов из клеток,Затем осадок клеток после удалениякислоторастворимых нуклеотидов ресуспендируют. в 15 мл этанола, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 25 мин. Надосадочную жидкостьотбрасывают, Процедуру повторяютЩдважды (удаление липидов). Полученный осадок клеток, не содержащихкислоторастворимых нуклеотидов и липидов, рвсуспендируют в 4 мп 0,5 н,ЧаОН. Гидролиз проводят при 37 Со в течение ) 8-20 ч (щелочной гидролиз), отделяют щелочестабильную фракцию ДНК, для чего щелочной гидролизат клеток охлаждают 30 мин в ледяной бане, добавляют НС 104 до конечной концентрации 6-7 (на 4 мп щелочного гидролизата 4 мл 15-ной НСРО 4), выдерживают в ледяной бане 15 мин. В этих условиях согласно оригинальному методу ДНК выпадает в осадок. Осадок щелочностабильной фракции ДНК отделяют центрифугированием при 2 С в течение 30 мин при 6000 об/минНадосадочную жидкость, представляющую собой смесь РНК и щелочелабильной фракции ДНК, сливают в чистую пробирку и проводят количественное определение щелочностабильной ДНК. Для этого осадок, содержащий щелочестабильную ДНК и неразрушенные щелочью белки, ресуспендируют в 4 мп 6-ной НСВТ, переносят в стеклянную пробирку, закрывают пробкой с каплеуловителем и 20 мин гидролизуют на кипящей водяной бане.Затем кислотный гидролизат охлаждают, центрифугируют 20 мин при 3000 об/мин, Осадок отбрасывают, в надосадочной жидкости спектрофотометрически определяют содержание щелочестабильной ДНК путем измерения поглощения при 270 и 290 нм, Е 0,160 р Е 0,105.Количество ДНК в пробе рассчитывают по формуле А.С. Спирина (1958)(Е 27 о ЕгяоМо,1 РДНК 019где Сдн - количество ДНК в пробе,мкг;Е - экстинкция раствора фрак 270ции при 270 нм;Е о- экстинкция раствора фракции при 290 нм 110,1- пересчетный коэффициентдля ДНК;0,19- разность между удельнымиэкстинкциями при 270 и290 нм;Р - степень разведения. фракции.(01 Ь 0-0,105) 10,1 4С =1 :1,69У Затем проводят отделение щелочелабильной фракции ДНК,Надосадочную жидкость после отделения осадка щелочестабильной ДНК(8 мп),. представляющую собой смесьРНК и щелочелабильной фракции. ДНК,делят на две равные части. Однучасть (4 мл) используют для количественного определения РНК, Другуючасть (4 мл) нейтрализуют ИаОН дорН 7,0 по лакмусу, добавляют двойной. объем холодного этанола (96,8 мп) и выдерживают 1 ч при -6 С.При этом фрагменты щелочелабильной55 бО ДНК выпадают в осадок. Осадок отделяют надосадочной жидкости центрифугирсванием при 2 ОС в течение 1 ч при 8000 об/мин. Надосадочную жидкость отбрасывают и проводят, количественное определение щелочелабильной ДНК.Полученный осадок ресуспендируют в 4 мл 6-ной НС 104, переносят в стеклянную пробирку, закрывают пробкой с каплеуловителем, гидролизуют на кипящей водяной бане 20 мин, Охлеждают, центрифугируют. Надосадочную жидкость спектрофотометрируют при 270 и 290 нм. Е 0,355;Е 29 п 0,5225.По формуле А.С. Спирина определяют содержание щелочелабильной ДНК в пробе.(озБ 5-о,2 гя (о,1 4 Сдк=дщг=Л,28 мкг3 Поскольку для определейия щелочелабильной фракции ДНК берут половину исследуемой пробы, то в формулу вводится коэффициент 2, который позволяет учитывать ДНК в целой пробе.Для определения суммарного количества ДНК в пробе необходимо учесть щелочестабильную и щелочелабильную фракцию ДНК.С =С +Сднк сумм днк щелочеста 5. днк щелочелаь= И,Ь 9 мкг Т 5,28 мкг:66,91 мкг Количественное определение РНК.Вторую половину фракции, содержащей смесь РНК и .щелочелабильной ДНК, используют для количественного определения РНК, для чего 4 мл переносят в стеклянную пробирку, закрывают пробкой с каплеуловителем, гидролиэуют на кипящей водяной бане 10 мин, охлаждают, центрифугируют. Надосадочную жидкость спектрофотометрируют при 270 и 290 нм. Е 1,100 Е 29 о 0,500. Количественное содержание РНКопределяют по формуле А.С. Спирина(Е 27 о-Е 29 о)10,5 Ррнк0,19 количество РНК в пробе, мкг;экстинкция раствора Фракции прн 270 нм;экстинкция раствора фракции при 290 нм;пересчетный коэффициент для РНК;разность между удельными экстинкциями при 270 и ь 90 нм;степень разведения фракции=265, 3 мкгКоэффициент .2 вводится также, как и при определении щелочелабильной ДНК, для учета РНК во всейпробЬ, а не в половине ее,Поскольку во фракции РНК имеетсящелочелабильная ДНК, необходимосделать поправку, вычитая из общего количества РНК щелочелабильнуюфракцию ДНК.265,3 мкг - 55,28 мкг = 210,02 мкг.Для определения количественногосодержания ДНК и РНК в клетке подсчитывают концентрацию клеток вбульонной культуре. Подсчет клетокпроизводят в камере Горяева. В данном опыте 1 мл бульонной культурысодержит 351 млн клеток, Учитывая,что для эксперимента взято 25 млбульонной культуры, общее количествоклеток в пробе составляет 8,78 млрд.Суммарное количество ДНК в пробе66,97 10 г, РНК - 210,02 10 г,ДНК в клетке - 66,9710 г; 8,78. 10=-ь- 7 6 10 г, РНК в клетке - 210,02 "ЮО г; 8,78 10 = 23,910 г.Таким образом, предлагаелий способ позволяет более полно и точноотделить ДНК и РНК и в связи с этимучитывать не менее 88 бактериальнойДНК, вместо 18-62, выявляемых прииспользовании известного классического метода Шмидта-Таннхаузера. Формула изобретенияСпособ фракционирования нуклеино,вых кислот бактерий, предусматривающий удаление свободных нуклеотидов и липидов иэ клеток бактерий, щелочной гидролиз клеток и клеточной рибонуклеиновой кислоты, осаждение дезоксирибонуклеиновой кислоты и белков из гидролизата, отделение надосадочной жидкости, содержащей рибонуклеотиды, от осадка, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью более полного и точного разделения нуклеиновых кислот на фракции, надосадочную жидкость делят на две равные части, одну из которых обрабатывают этанолом для осаждения дезоксирибонуклеиновой кислоты и осадок гидролизуют кислотой, после чего проводят количественное определение в полученных гидролизатах суммарной клеточной дезоксирибонуклеиновой кислоты, а другую часть надосадочной жидкости гидролизуют и в полученном гидролиэате определяют количе:твенное содержание рибонуклеиновой кислоты. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе 1. д. ЯсЫп 1 Ж Я. ТЬаппЬапзег Л, оГ В 1 о 1. саед, 1945, 161, У 1. 83-89.