Способ получения тканевого аллергена для диагностики аутоаллергических процессов при хроническом тонзиллите

(51) А 61 К 39 00 ПИСАНИЕ ИЭОБРЕ ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ л. Р 13 А.Д,Базавлук,икий, В.ф.филат.50-53.Журнал ушвеэней,У 4 ых нос9, В 4 ых и горлос.34-38,вых б ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ(71) Харьковский научнотельский институт микровакцин и сывороток им,(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТКАНЕВОГОАЛЛЕРГЕНА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ АУТОАЛ -ЛЕРГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ТОНЗИЛЛИТЕ, включающий гомогенизацию ткани миндалин человека, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью повышения специфической активности аллергена, полученный послегомогениэации осадок промывают физио.логическим раствором и обрабатыва-ют 1 н. раствором соляной кислотыпри нагревании, отделяют насадочнуюжидкость, далее нейтрализуют еераствором щелочи, стерилизуют илиофилизируют.Изобретение относится к медицине,а именно к способам получения тнаневого аллергена для диа 1 ностикиаутоаллергических процессов прихроническом тонзиллите,Известен способ получения тканеного аллергена для диагностики аутоаллергических процессов при хроническом тонзиллите путем гомогениэации ткани миндалин человека с последующим отделением надосадочной жидкости, используемой затем н качествеаллергена Г 13Недостатком данного способа является невысокая специфическая активность получаемого аллергена, что 15затрудняет аллергоциагностику хронического тонэиллита,Известен способ получения тканево"го аллергона для диагностики аутолаллергических процессов при хроническом тонэиллите, включающий гомогенизацию ткани миндалин человека 23.Недостатком указанного способаявляется низкая специфическая актинности аллергена (аллергические реакции при определении 1 п ч 11 го положительны у 38 здоровых людей и у76 больных хроническим тонэиллитом) .Цель изобретения - повышениеспецифической активности аллергена.Поставленная цель достигаетсятем, что согласно способу получениятканевого аллергена для диагностикиаутоаллергических процессов прихроническом тонзиллите, включающему З 5гомогенизацию ткани миндалин человека, полученный после гомогенизации осадок промывают физиологическим раствором и обрабатывают 1 н.раствором соляной кислоты при нагреванин, отделяют надосадочную жидкость,далее нейтрализуют ее раствором щелочи, стерилизуют и лиофилиэируют. Способ осуществляется следующим 45образом.Удаленные во время оперативных вмешательств небные миндалины отмывают физиологическим раствором хлори да натрия, взвешивают и измельчают в блендоре в присутствии 15 мл физиологического раствора хлорида натрия в течение 10 мин при 3000 об/мин. Полученный гомогенат центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин. Осадок трижды отмывают при центрифугировании избытком физиологического раствора. Режим центрифугирования 5 мин 1000 об/мин. Полученный осадок отжимают между листами Фильтровальной бумагиПолученный осадок гомогената мин О далин подвергают кислотному гидролизу 1 н. раствором соляной кислоты из расчета 200 мл 1 н. НС 1 на 4 г влажной массы осадка. Гидролиз ведут в течение 30 мин при кипячении. 65Сухой остатокНелетучие солиПептидыРедуцирующие моносахараАминокислоты СледыСоли жирных Следы кислотНуклеотиды СледаОлигосахариды 9,40Аминный азот 0,012Средний молекулярный нес. 5000 уе. Основу биологически активного начала аллергодиагностикума составляют олигосахариды, представленные в ткани миндалин в составе соединительнотканных и ретикулярных волокон. Последнее объясняет высокую диагностическую ценность полученного аллергена и дает возможность его химической идентификации. 13,603,600,400,20 Гидролиэат охлаждают до 20 С, после чего нейтрализуют 1 н. раствором ,гидроксида натрия (ИаОН) под потенциометрическим контролем до рН 7,1.Нейтрализованный продукт центрифугируют в течение 30 мин при 8000 об/мин. Осадок отбрасывают.1 мл надосадочной жидкости упаривают досуха под вакуумом при 10 мм рт. ст. и 50 С до постоянного веса, Производят взвешивание.с Затем сжигают навеску в муфельной печи прио800 С и повторно взвешивают. Содержание органических веществ определяют по разности результатов перного и второго взвешивания.Исходя из полученных результатов весоных определений, аллерген стандартиэуют по навеске органических веществ до значений 10 мг/мл, проводя в зависимости от результатов упаривание в условиях вакуума при 10 мм рт.ст. и 40 С или разведение физиологическим раствором хлорида натрия, В полученном аллергене повторно определяют количество органических веществ.Полученный стандартный раствор аллергена подвергают стерилизующей фильтрации через фкльтр Зейтца., Раствор аллергена н стерильных условиях разливают в стерильные ампулы из нейтрального стекла объемом 3 мл и лиофилиэируют при следующем режиме: вакуум 0,2 мм рт.ст. Т 20 ОС;время йиофилизации 17 ч 1 время досушивания при комнатной температуре 6 ч.Полученный при лиофилизации аллерген представляет собой белый . порошок, гигроскопичный и легкорастворимый в воде.Полученный по предлагаемому спое собу аллерген имеет следующий химический состав (расчет содержания в 1 мл), мг:С учетом химического родства полученного аллергодиагностикума гепарину для идентификации предлагается метод определения тлерантности плазмы к гепарину. Опыт проводят путем сравнения биологической актив ности гепарина и полученного аллергодиагностикума с использованием общего контроля, предуомотренного методикой; Результаты сравнительных исследований трех серий полученного 10 аллергодиагностикума однозначно показали, что он обладает антикоагуляционной активностью, уступая тем не менее гепарину (90 активности от гепарина) . Предлагаемый метод идентификации надежен, легко понторим, методически прост, доступен для использования в любых условиях.Активность аллергена, полученного по предлагаемому способу, изучена в опытах 1 п чего по тесту ППН (показатель повреждения нейтрофилов), который нашел весЬМаширокое применение в клинике и лабораториях как ф метод аллергодиагностики, имеющий преимущество перед внутрикожными пробами (полная безопасность, более высокая чувствительность, отсутствие противопоказаний) .Аллергодиагностике были подверг нуты 58 больных хроническим тонзиллитом и 20 здоровых людей (контроль). Для постановки реакции ППН использованы 3 серии аллергена, изготовленного по предлагаемому способу и 3 35 серии аллергена, полученного по способу-прототипу,Стерильный пипеткой в 3 стерильные видалевские пробирки вносят по 400,08,мл свежей несвернувшейся крови,В одну из этих пробирок, служащуюопытом, вносят 0,02 мл изучаемоготканевого аллергена, в другую -такое же количество известного аллергена, полученного по способупрототипу,Аллергены для постановки реакцииППН разводили следующим образом:1,0 мл жидкого аллергена (концентрации 100 мг ) смешивали с 0,25 мл25-ного раствора цитрата натрия. При этом конечная концентрация антикоагулянта в аллергене составляла 5. В третью, контрольную пробирку добавляли 0,02 мл 5 цитрата натрия. После инкубации пробирок в течение 2 ч в термостате (37 С)из каждйй:.пробирки готовили мазки,высушивали на воздухе, фиксировали,обрабатывали по Шабадашу и окрашивали гематоксилином в течение 5 мин.Для оценки теста ППН просматри-.вали 100 нейтрофилов в контрольноми опытных мазках. Результаты подсчета обрабатывали по формулеН- Н100где Н - число поврежденных нейтрофилов в опыте;Н - число поврежденных нейтрофилов в контроле;100 - количество просмотренныхв мазке клеток.Данные опытов представлены в таблице.Испытание 1 п чего в тесте ППН полученного по предлагаемому способу аллергена с кровью здоровых и больных компенсированным и декомпенсированным хроническим тонэиллитом пОказали его высокую диагностичес- кую активность (абсолютные значения теста ППН превышали данные прототи" па при компенсированном тонзиллите в среднем в 2,3 раза и при декомпенсированном хроническом тонэиллите - в 2,7 раза.Наличие достоверных отличий в диагностических показателях теста ППН при компенсированном хроническом тоизиллите и декомпенсированном хроническом тонзиллите позволяет проводить дифференциальную диагностику форм хронических тонзиллитов и определять соответствующие методы лечения.сПредложенный способ методически прост, доступен и экономически выгоден (не требует дорогостоящих. реактивов, обррудования и больших затрат рабочей силы и времени).1084025 форма заболевания Разница Результаты опытовс аллергеном Числообследованных Серияантигена предлагаемым Со 1 10 10 10 Составитель Л.МалышеваР дактор М.дылын Техред Т.Дубинчак Корректор А.Тяско Заказ 1853/5 Тираж 688 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская ваб., д.4/5 Хроническийкомпенсированный тонзиллитХронический декомпенсированный тонзиллитКонтроль