Способ выделения нуклеиновых кислот хлопчатника или их аминокислотных комплексов

ОП ИЗ Соаз Советски СоциалнстнческРеспублик(23) Приоритет С 07 Н 21/00//А 61 К 29/00 Государствениыи комите СССР по делам изобретений и открытийОпубликовано 1 53) УДК 547.963.3 07 (088 8) ата опубликов г)двт ризобретения Каракузи Заявитель 4) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ХЛОПЧАТНИКА ИЛИ ИХ АМИНОКИСЛОТНЫХ КОХПЛЕКСОВИзобретение относится к усовершенствованному способу выделения нуклеиновых кислот хлопчатника или их аминокислотных комплексов, необходимых для биологических, биохимических и Физиологических исследований,Известен способ выделения нуклеиновых кислот хлопчатника или их ажнокислотных комплексов путем хроматографического разделения на колонках с Метилированным альбумином на кремниевой кислоте с последующим осаждением посредством добавления белка- носителя животного происхождения (каэеин молока), Выход нуклеиновых кислот или их комплексов 68-74 1).Недостатком известного способаявляется относительно невысокий выход : целевого продукта.Цель изобретения - повысить выход целевого продукта.Цель достигается применением в качестве белка-носителя для осажде" ния нуклеиновых кислот хлопчатника или их аминокислотных комплексов глютелина хлопчатника, что, позволяет повысить выхоД целевого продукта до 93-95 благодаря сродству глюте" пина хлопчатника к нуклеиновым кислотам хлопчатника. Способ выделения нуклеиновыхкислот хлопчатника или их аминокислоных комплексов согласно изобретениюзаключается в хроматографическом5 разделении на метилированном альбумине на кремниевой кислоте с последующим осаждением целевого продуктапутем добавления глютЕлина хз 1 опчатни ка. Выход 93-95 .10 При мер,Получение глютелина. Свежий растительный материал (например, семена хлопчатника) фиксируют 85-нымацетоном и промывают несколько раздо исчезновения пигментного вещества.Бело-буроватый порошок, освобожденный от пигмента, для удаления ацетонапромывают эфиром, высушивают и хранят до анализа под щелочью (КОН)20 в вакуум-эксикаторе,В коническую колбу берут 10 гэтого порошка, заливают 10-кратным,количеством 0,2-ного ИаОН (добавля 25 ют две капли толуола и сухого порошка бисульфата натрия с таким расчетом,чтобы в конечном итоге в смесибисульфата натрия концентрация НаОНбыла 0,2) . Экстрагирование проводят3 О на магнитной мешалке в течение 1 ч тсесоюэный ордена Ленина научно-исследовательский институт хлопководстваЙгллЛ , " л" ил выдерживают в холодильнике приО С 15 ч.Такую экстракцию проводят центрифугированием еще три раза. Объединйютсупернатант и ставят на диалиэ. Приэтом щелочерастворимые белки выпадают в осадок. Осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 0,2-номМаОН и опять ставят на диализ. Та кая процедура повторяется три раза,тПосле этого можно применять глютелиндля осаждения. Но для более полногоочищения глютелина после диализа его.центрифугируют, осадок растворяютв 0,2-ном растворе щелочи МаОН, к нему добавляют уксусную кислоту в такомколичестве, чтобы общее содержание 15ее в смеси было 4,4,Полнота осаждения проверяется вотдельной пробе. Выделившийся приэтом хлопьевидный осадок белка центрифугируют и растирают в ступке с во Одой, воду сливают и вновь добавляют.Этот процесс растирания продолжаютдо тех пор, пока в промывной воде небудет обнаруживаться сахар. После" слегка опалесцирующего раствораглютелин вновь осаждают прибавлениемуксусной кислоты до конечной концен,трации в смеси 4,4. Эту процедуруперерастворения и переосаждения белка повторяют три раза и каждый разцентрифугируют, После последнего переосаждения осадок белка промываютводой для удаления уксусной кислотыи затем спиртбм, проьытый спиртомосадок переносят на фильтр. Спиртвытесняют эфиром на водоструйномнасосе, Осадок сушат в вакуум-эксикаторе Выход глютелина 25-30 40(2, 5-3 г),Фракционирование нуклеиновыхкислот, На колонку, заполненную метилированным альбумином на кремниевой кислоте (МАК), уравновешенную0,02 М натрийфосфатным буфером рН 6,8,наносят 400 опт.ед. суммарных нуклеиновых кислот. Элюцию проводят линейным градиентом в концентрации хлористого натрия 0,1-1,0 М, содержащим0,0 2 М Фосфатный буфер, рН 6,8- и сбор Фракций. 9-10 мл,Затем содержимое пробирки разделяют поровну на две пробирки, осаждают казеином и глютелином, в пробир-.ки добавляют по три капли 1-ного"раствора казеина и глютелина и дваобъема холодной 10-ной НСВ 04. Фракционирование суммарныхнуклеиновых кислот на колонкеМАКНу клеиновыки слоты сажд ие с азеи е о НК 8 9 3 9ДНК иРНК 24 22 юФ.:.; ЯЩ Формул зобретейия Щт Полнотуосаждения проверяют в отдельной пробе, Результаты исследований показали, что нуклеиновые кислоты осаждаются с глютелином на 20-26 больше; "чем с казенном;"Полученные результаТы прйведены в таблицерРНК 74 9319Фракционирование комплекса нуклеиновых кислот. На колонку (Зх 25 см),заполненную МАК, уравновешенную0,02 М Юа-ацетатным буфером рН 5,2,содержащим 0,1 М ИаС 1, медленносорбируют 5 мг С -фенилаланил-тРНКи промывают ее тем же буфером дополного удаления неадсорбированногокомплекса. Элюцию проводят линейнымградиентом в концентрации БаС 1 (0,11,.0 М) в 0,02 М Иа-ацетатном буфере,содержащем 110 М МдСР,. Скоростьэлюции 25-30 мл/ч, объем фракции3-4 мл, После измерения оптическойплотности при 260 нм С -фенилаланилитРНК в каждой фракции осаждают равным объемом холодной 5-ной НСКОМ.Результаты фракционирования Си-фенилаланил-тРНК на колонках с МАКприведены на графике,В каче ст ве адсор бент а носителя .прибавляют 0,2 мл 1-ного раствораказеина (а) и глютелина (б) . На графике приняты следующие обозначения:1 - оптическая плртность, 2 - радиоактивность, 1, 11 и 111 - изоакцепторные формы Сц-фенилаланил-тРНК,Выпавший осадок сОбирают центрифугированием, растворяют в 0,5 М НН ОНпереносят. на мишень, высушивают иподсчитыв ают ралдйоакти вйослт ь.Как видно из приведенного, активностЬ СМ-Фенилаланил-тРНК 1, 11 и111 изоформ больше на 22-25, когдаприменяйт в качестве носйтеля глюте-лин вместо казеина; 55Способ выделения нуклеиновых кислот хлопчатнйка или их аминокислотныхкомплексов путем хроматографическогоразделения на метилированном альбумине на кремниевой кислоте с последую- .60 щим осаждением целевого продуктапосредством добавления белка-носителя,отличающийс я тем, что,с целью повышения выхода целевогопродукта, в качестве белка-носителя б 5 используют глютелин хлопчатника.на ор ор к з 1070/2 аж 495 Подписиударственного комитетам изобретений и открытий а, Ж, Раушская наб. еСС 5 ф, г. Ужгород, ул ектная,4 ф фПат ли ал Источники информации,принятые во внимание при экспертизе 1. Каракуэиев Т.У. Действие-облучения на функциональную активТир ЦНИЙПИ Рос по дела 035, Моск