Способ получения -рибулозо5-фосфата

Союз Со Социапис РЕ тскихескихик(23) ПриоритетОпубликовано 15 2 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий,Г, Доман 72) Авто из обре Н,Г. Русинова, Ле Тхи Лан Оань (СРВ ния енина Институт биохимии им, А.Н.Баха 71) Заявитель 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Р-РИБУЛОЗО-ФОСФАТА Р-рибулозо -5ется ценнымРибулозо-фотом уникальнКальвина-фосИзвестенбулоэо-фосного превращ ри бузованкем экстракта полученного в 0,05 М 3овле Изобретение относится к усовершенствованному способу получения-Фосфата,который являбиохимическим реактивом.сфат является субстраого фермента циклафорибулокиназы,способ получения Р-рифата путем ферментативения Р-рибозо-фосфата 10в присутствии высокоочищенной рибо-.зофосфатизомераэы, выделенной иэлистьев шпината, и зпимеразы при38 фС с последующим выделением целевого продукта фракционированием этаиолом. Чистота продукта .30 1,Недостатком известного способаполучения Р-рибулозо-фосфата являются многостадийность и сложностьполучения двух высокоочищенных ферментов: рибозофосфатизомеразы иэпимераэы, а также невысокая чистотацелевого продукта (30) .Целью изобретения является упрощение процесса и улучшение качества 25целевого продукта.Цель достигается испольв качестве биокатализаторалистьев РЬавео 1 цв ацгецв,при гомогенизации листьев трис-НСР . буфере с рН 7,0-7,1 в присутствии 0,2 М БаСР, 0,005 М этилендиамин И,И,И,И-теграуксусной кислоты(ЕДТА) и 0,1 М дитиотреитола и осуществлением ферментативного превращения при 62-65 оС в течение 5-6 мин,что позволяет исключить из процессавысокоочищенные ферменты,Способ получения Р-рибулоэо-фосфата заключается в Ферментативномпревращении Р-рибозо-фосфата в присутствии экстракта из листьевРЬавеоРця ацгеця, полученного пригомогенизации листьев О, 05 М трис-НСРбуФером с рН 7,0-7,1 в присутствии0,2 М ВаСР, 0,005 М ЕДТА и 0,01 Мдитиотреитола, при 62-65 оС в течение 5-6 мин. Чистота целевого продукта в виде бариевой соли 79,6-83,2.Бариевая соль переводится в натриевую путем добавления к кисломураствору бариевой соли (рН 6,0-6,5)эквивалентного количества сульфатанатрия с последующим быстрым замораживаиием и высушиванием, Чистотанатриевой соли 83,П р и м е р 1Получениелозо-фосфата натрия.Выращивание РпавеоРцв ацгеця призводят на почве или песке с доба727657 вием питательного раствора Пряниш- при 4 С, Осадок удаляют центрифугиникова в оранжерее в течение 2-3 нед рованием. Поверхностную жидкость,при т. 15-30 С.ополученную после центрифугирования,Для получения экстракта листья нейтрализуют 0,5 н. МаОН до рН 6,0,присутствии 0,2 М БаС 6 0,005 М этанолом. Выпал обильный осадок.ПосЕДТА и 0,01 М дитиотреитола. Говв- ле центрифугирования осадок собигенат фильтруют через 3 слоя марли, рают и высушивают лиофильно. Выходцентрифугируют при 17000 д в тече- рибулозо-фосфата составил 57 илиние 30 мин. Поверхностную жидкость .2800 мг,(экстракт) используют для фермен- . Состав ферментной смеси для протативного синтеза. веркиактивностифосфорибулокиназы вСостав ферментной смеси для прев- присутствии полученного Р-рибулозоращения Ь-рибозо-фосфата в Р-ри- -5-фосфата цистеинкарбазаловым ме"булоэо-фосфат: 15 тодом, мкмоль/мл ферментной смеси;трис-НС 0,005 М, Хлористый магний . 10рН 7,1, мл 50 Дитиотреитол 2дитиотреитол 5000, Р-ри було зо-фо сфат 2мкмоль. 5000 АТФ 3экстракт (350-400 мг 20 трис-НСЮ 0,05 М, рН 7,9 40белка) р мл 65 Экстракт, содержащийри бозо-фос Фат, белка, мг 0,5мкмоль 10000 Результаты проверки ферментативРеакцию начинают добавлением в фер- ной активности, анализ полученногоментную смесь рибозо-фосфата. 5 Р-рибулозо-фосфата на фосфор предРеакцию провбдят в течение 5-6 мин ставлены в таблице. Анализы показалипри 62-65 оС. Белок ферментной смеси соответствие формулеосаждают 5-ной трихлоруксусной СНОР Ва 7 Н Окислотой (конечная концентрация)С.Н ОР Иа 5 Щ)Результаты анализа полученного Р-рибулозо-Фосфата в виде бариевой и натриевой солейна содержание фосфора,и ферментативную активность парат н Р-Ри булозо, 7,8 83,2 Р-Рибулозо-фос фатн атриев аясоль 2,0 3,0 390 Мед белка э ракта. и листьев маша т Осадок сульфата бария удаляют центрифугированием. Супернатант, содержащий натриевую соль Р-рибулозо-фос-фата, быстро замораживают, высушивают сначала лиофильно, затем ввакуум-зксикаторе над Р ОВ при 0-4 С.Потери при переводе Р-рйбулозо- ЮО "фосфата бариевая соль в Р-рибулозо-фосфат натриевая соль составляют около 10.Результаты анализа полученногоР-. рибулозо 5-фосфата.натриевая соль д на содержание фосфора (в) и фермен Пример 2. Получезо-фосфата натрия.В качестве исходного вдля получения натриевой солозо-фосфата используютсоль Р-рибулозо-фосфата-5-фосфат бария растворяютмальном количестве бидистиной воды при 0-4 С. Получвор доводят до рН 6,0-6,5кислотой и добавляют в неколичество (по содержаниюР-рибулозо-фосфате)мкмо ие рибулощества ли Р-рибубариевую Рибулозов мини- ллированнныйраст- соляной о равноебария вль -МаВО727657 Составитель Л. НикулинаТехред М. Кузьма Корректор, С. ШекмарфАТираж 495 ПодписноеЦНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и:,открытий13035 Москва ЖРауюская наб., д. 4/5 Редактор Т. Дев ятко Заказ 1070/25 11 Уфилиал ППППаТентф 1, г. Ужгород, ул. Проектная,4 тативную активность представлены в таблице.Результаты ферментативной проверки свидетельствуют о высоком качестве полученного препарата Р-рибулозо-фосфата натрия. Активность 0-рибулозо-фосфата в виде бариевой и натриевой солей при хранении (-20 С) не снижается в течение 6 мес. Формула. изобретения10 СпОсоб получения 0-рибулозо" -фосфата путем ферментативного прев-. ращения О-рибозо-фосфата в присутствии биокатализатора при повышенной температуре с последующим выделением целевого продукта фракционированием этанолом,.о т л и ч а ющ и й с я ;тем,что,. с целью упрощения процесса и улучшения качествацелевого продукта, в качестве биокатализатора используют экстрактлистьев РЬазеоСцз ацгецз, полученный(при гомогенизации листьев в 0,05 Мтрис-НСЯ буфере с рН 7.,0-7,1 в присутствии., О, 2 М йаСС, 0,005 М этилендиамин Н,В,Я,Н-тетрауксусной кислоты и 0,01 Й дитиотреитола, и ферментативное превращение осуществляютпри 62-65 С в течение 5-6 мин,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. В.Ь. НогесЫег. Ргерага 11 оп апйапаВуз 1 з ой г 1 Ьц 9 озе-рйозрЬа 1 е,"МеОойз 1 п Епгупю 9 оду", 3, с. 190192 (1957) (прототип).