Способ получения 5 -цианэтиловых эфиров -защищенных дезоксирибоолигонуклеотидных блоков

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советских Социалистических Республик(23) Приоритет Гос) дарственный комитет СССР но делам изобретений н открытий(53) УДК 547, 9 б 3. ,32.07(088.87 Опубликовано 2502,80. Бюллетень 89 7 Дата опубликования описания 250280(72) Автор изобретения А.Ю. Мишарин Институт молекулярной биологии ьН СССР(54) СПОСОБ. ПОЛУЧЕНИЯ 5-ЦИАНЭТИЛОВЫХ ЭФИРОВИ -ЗАЩИЩЕННЫХ ДЕЗОКСИРИБООЛЙГОНУКЛЕОТИДНЫХБЛОКОВ Изобретение отяосится к усовершенствованному способу получения 5-цианэтиловых эфиров Ч -защищен- . ных дезОксирибоо.игонуклеотидных 5 блоков, являющихся промежуточными продуктами синтеза олигонуклеотидов, важного класса природных соединений, широко применяющихся в биологических исследованиях. 10Известен способ получения 5-цианэтиловых эфиров й -защищенных олигонуклеотидов, заключающийся в конденсации 5-цианэтиловых эфиров Й -защищенных дезоксирибонуклеотидов15 с 3-О-ацетильными производными й -защищенных йуклеозидс.фосфатов, в присутствии мезитиленсульфохлорида или 2,4,б-триизопропилбензолсульфохлорида с последующим удалением 3-О- защитной группы действием водной щелочи и .5-цианэтилировании полученного 11 -защищенного динуклеотида в присутствии дициклогексилкарбодиимида (1)25Недостатками известного способа получения 5-цианэтиловых эфиров защищенных дезоксирибоолигонуклеотидных блоков являются многостаднйность процесса, невозможность избирательного отщепления 3-О-ацильной защитной группы в присутствии 5-цианэтильной, проведение 51-цианэтилирования в присутствии больших избытков дициклогексилкарбодиимида (ДЦК) и гидракрилонитрила.Целью изобретения является упрощение процесса.Указанная цель достигается испОльзованием в качестве 3-О-ацильных производных 3-О-метоксиацетильных производных нуклеозид-фосфатов и удалением 3-О-защитной группы обработкой полунасыщенным раствором аммиака в абсолютном метаноле в течение 10-12 мин, что позволяет избирательно удалять только 3-О- защитную группу и изъять из процесса стадию цианэтилирования динуклеотида, а также большое количество токсичных реагентов (ДЦК). Способ получения 5 -цианэтиловых эфиров й -защищенных деэоксирибоолигонуклеотидных блоков, согласно изобретению, заключается в конденсации 5-цианэтиловых эфиров М -защищенных дезоксирибоолигонуклеотидов с 3-О-метоксиацетильнымиОКХ(а-г) ОН3 ЯФСН 2 О Р 6 СН 3ф 110 Р - 0601 ВООК1 т а)Р= О - СН Раствор"упарйвают-,-переупаривают сабсалютПЖ э"Гайолом";" затем сизопропаном; Остаток промывают 4 х 5 млабсоЛЮтйбго"Изопропанола, продуктвыделяют Фйльтрованием или центрифугированием" в виде литиевой соли,промывают абсолютным эфиром и сушат в вакууме. Выход соединений,%:Й а 93; 1 Ч б 90; Ц в 92; П г 95. Приэтиловог(О % вают упдином; 3 71706 производными й -"защйщенных нуклеозйд-Фосфатов"с последующим удалением 3-О-метоксиацетильной группы обработкой полунасыщенным раствором аммиака в абсолютном метаноле в течение 10-12 мин. Строеййеполучейных соединений подтверждено данными хроматографического анализа, Уф-спектрами и методом ПМР.П р и м е р 1. Получение 3-О-метоксиацетйльйых йрой зводйых-дезок- синуклеозид-фосфатов (6 а-г) 0ОеМ(СН 1)Р - Р-йЬ В) 0О Ф ИОНП 1 (а-В) УПиридиниевую соль 1 а-г (1 ммоль)высушивают упариванием с абсолютнымпиридином,растворяют в 5 мл абсолютнбго пиридина, добавляют 1 мл мето"ксиуксусного" айгмадрида, вйдеРжио 5вают 4 ч при 20 вС, добавляют 2 млабсолйтногоэтанОла при 0 С и выдерживают 1 ч при ОфС. Растворйтель == ".удаляютв вакууме до сиропа, про"мывают Зх 10 мл абсолютного эФира,декантируя растворитель, Остатоквыдерживают в 10 мл 50-ноговодноого пиридина ) ч при 20 С, упаривают, цереупаривают" 3 х 5 мл вбдыйпропускают через колонку с 5 смСмолк Дауэкс(Ъчф), элкйруяво- дой 3 4В соединениях 1 и Йа) В-тимин 1б) В-й-б-бензоиладенин;в) В-Н-бензоилцитозинг) В-)-2-ацетилгуанин.В соединенияхИ ига) Вф-В-тимин;б) В-В-М-б-бензоиладенин;в) В-Мб-бензоиладенин, В-М-бензоилцйтозин.В соединении М:В ф-В-тимин, В-Ю.-4-бензоилцитидин м е р 2. Получение 5 ф-цнано эфира дезокситимидилил-"дезокситимидина (1 Ч а).пирициниевых солей Ма оля) и П а (1 миоль) высушиариванием с абсолютным пири- растворяют в 5 мл абсолют717063 Формула изобретения Составитель Л. НикулинаКорректор Г. Решетник Редактор В. Минасбекова Техред М,Келемещ ж 495 ПодписноеЗаказ 9752/29 ТиражЦНИИПИ Государственного комитета СССРпо дделам изобретений и открытий4/5113035, Москва, Х, Раущская наб., д. /оектная, 4филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Про "ного пиридина, добавляют 3 ммолямезитиленсульфохлорида, смесь концентрируют до объема 3 мл и перемешивают 3,5 ч при 20 фС, затемохлаждают до 0 С и добавляют б мл1 М триэтиламмонийбикарбонатногобуфера (рН 7, 5), выдерживают 14 чпри 4 оС, затем упаривают и переупаривают (Зь 5 мл) С 50-ным этанолом. Смесь растворяют в 5 мл полу-,насыщенного раствора КН в абсолютном метаноле, выдерживают 15 минпри 20 вС, упаривают, переупариваютс абсолютным этанолом, растворяютв воде, наносят на колонку (5 х 40 см)с целлюлозой ДЕ(НСО) и хроматографируют в линейном градиенте15концентрации й ННСО 3 (0-0,15 М 19 л) . Продукт упаривают, пере 9 паривают с водой и лиофилиэуют.Выход 52.П р и м е р 3. Получение 5-цианэтилового эфира )( -б-бензоилдезоксиаценилил-(3-5)-И-б-бензоилдезоксиа"деноэина (1 Ч б), Смесь пиридиниевыхсолей Цб (0,5 ммоля) и а б (1,0 ммоль)высушивают упариванием с абсолютным ЯЯпиридином, растворяют в 5 млабсолютного пиридина, добавляют 3 ммоля2,4,б-триизопропилбензолсульфохлори"да, смесь концентрируют до объема3 мл и перемешивают 4,5 ч при"29 С З 00затем охлаждают до -30 С, добавляютб мл 1 М раствора триэтиламина вабсолютном пиридине, выдерживаютпри охлаждении 1 ч, добавляют приОфС равный объем 1 М триэтиламмонийбикарбонатного буфера и оставляютна 14 ч при 4 фС. Водный растворэкстрагируют (4 х 50 мл) эфиром,упаривают, переупаривают (3 х 5 мл)с 50-ным водным этанолом, затем(5 х 5 мл) с абсолютным этанолом, 40растворяют в 5 мл полуиасыщенного раствора ЙН в абсолютномметаноле, выдерживают 15 мин при20 С, упаривают, переупаривают(3 х 5 мл) с абсолютным этанолом, 45растворяют в воде и хроматографируют, как в примере 1. Выход 44. П р и м е р .4. Получение 5-циан этилового эфира К -4-бензоилдезоксицитидилил-(3-5 ф)-К-б-бензоилдезоксицитидина (ЪЧ в).Нуклеозидный компонент - Йв 0,5 ммоля), нуклеотидный компонент- в б (1,0 ммоль), конденсирующий реагент - 2,4,б-триизопропилбензолсульфохлорид (3,0 ммоля). Методика аналогична примеру 3, Выход 40.П р и м е р 5. Получение 5-циачэтилового эфира дезокситимидилилв(3-5)-дезокситимидилил-(3-5 ф)- -М-бензоилдезоксицитидина () .Нуклеозидный компонент - 17 а (0,5 ммоля), нуклеотидный компонент" 9 в (1, 0 ммоль), конденсирующий реагент - мезитиленсульфохлорид (5,0 ммолей). Методика аналогична примеру 2. Выход 4.2. Способ получения 5-цианэтиловых эфиров )( -защищенных деэоксирибоолигонуклеотидных блоков путемконденсации 5-цианэтиловых эфиров)(-защищенных деэоксирибоолигонуклеотидов с 3-О-ацильными прбизводными й -защищенных нуклеоэид-фосфатов в присутствии мезитиленсульфохлорида или 2,4,б-триизопропилбензолсульфохлорида с последующимудалением 31-О-защитной группы,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью упрощения процесса, в качестве 3-О-ацильных производныхиспользуют метоксиацетильные производные И -защищенных нуклеозид-фосфатов, а последующее удалениезащитной 3-О-метоксиацетильнойгруппы осуществляют обработкой полунасыщенным раствором аммиака вабсолютном метаноле в течение10-12 мин.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1 лчеЪво й, м 1 опбпа н 4. ыидсеь оя Робч-,цсЫоЪ 1 дФь 0 В У.Мо 0 ВЙ 1972, 72,219-249 (прототип) .