Способ получения модифицированного водорастворимого препарата целлюлозы

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Соеетскик Социалистическик Республик/02/ 7/48 6 нением заяв присоед оеудар етенный коинтеСССРел ам нзобретеннйн открытнй Рз) пр оритетбликовано 15,(53) УДК 547.15 .07(088.8) Б тен Дата я 15.0 1.80 оп иков 2) Авторы иэобрете Балцере, А.К. Арен и Д.Я.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННОГО ВОДОРАСТВОРИМОГО ПРЕПАРАТА ЦЕЛЛЮЛОЗНЫ и 1 О вев- ова ееисп О 61) Дополнительное к авт. 1Изобретение относится к области олучения иммобилизованных ферментовОдним из перспективных направлений применения ферментов, в частности целлюлазы, является ферментативный гидролиз целлюлозы, в том числе целлюлозы-отходов лесной и деревообрабатывающей промышленности.Известен способ получения иммо лизованной целлюлазы с использова нием пенополиуретана в качестве матрицы (1); по этому способу получают нерастворимый препарат целлюлазы. Однако процессы переработки целлюлазы, твердого и.плохорастворимого субстрата, требуют применения растворимых целлюлазных препаратбв.Известен способ получения модифици- рованного водорастворимого препарата целлюлозы путем связывания целлюлазы с полимерами (2), представляющими собой синтетические сополимеры этилена и малеинового ангидрида, винил 2 ацетата и малеинового ангидрида и др.Растворимый препарат целлюлазы получают обработкой фермента суспензией сополимера в буфере (рН 7,48) при перемешивании в течение 24 ч при.4 С. Затем проводят центрифугирование, диалиэ и лиофилизацию.В связи с тем, что применяетсябольшая по отношению к полимеруконцентрация фермента (фермент; полимер - 1:0,25), происходит поперечная сшивка молекул полимера ферментом. Это вызывает образование конечных продуктов с большой молекулярной массой и, следовательно,плохой растворимостью.Выход растворимого препарата целлю.лазы 18, активность 60 от исходнойактивности фермента,Данный способ обеспечивает относительно низкий выход целевого продукта и сопровождается значительнымипотерями фермента,Целью изобретения является уличение выхода препарата. Посталенная цель достигается использнием при иммобилизации целлюлазыприродного полимера-альбумина, предварительно активированного.Описывается согласно изобретению,способ получения модифицированноговодорастворимого препарата целлюлазы путем ковалентного связыванияс полимером, в качестве которогоользуют природные полимеры -а)1 ь буми ны, акти вкрова и ные глутаровым цкальдегкдом при вет-.,оном соотношент 1 и альбуминг глутароный дкальдегкд:8-25, а связывание целлюлаэы с полимером проводят при весовомсоотношении целлюлаэа; полимер 1:1-3.Ввиду того, что используются товарныеальбумкны, содержащие Фракции с различным содержанием ИН 2-групп к различной молекулярной массой к нвидувозможных стерических затруднений,глутаровый диальдегид берется в избыточном количестве. В этом случаеусловия активирования альбуминон оптимальные для введения максимальногоколичества, СНО-групп, активных поОтношению к ИН -группам фермента.2Высокое содержание активныхСЧО-групп н активированном альбумкне и небольшая концентрацияФерме.та по отношению к полимеруспособствует присоединению нескольких ИЛ 2-групп целлюлазы к одноймолекуле альбумина и тем самымограничивает рост молекулы целевого продукта, что обуславливаетхорошую растворимость последнего.Кроме того, окружение Ферментаальбумином электростатически заряженным природным полимером, также увеличивает гидрофильность препарата,В 11 сокая концентрация альбуминаполностью обеспечивает присоединеке целлюлаэы и ксключает потериФермента.Процесс обычно проводят следующк:,. образом.льбу;,1 ин (2-ный раствор) активируют глутароным диальдегидом ,(25-ныйраствор) пои весовом соотношении1:8-25 н течение 24 ч при 20 С, отделяют избыток дкальдегида гельфильтрацкей на сефадексе Л, с послецующкм связыванием фермента и актинкрованного альбумина в течение 24 чпрк 2 О тС Выход препарата в пересчете нацеллюлазу и альбумин 100, активность его превышает активность исходной целлюлаэы на 30-40.П р и м е р 1. 0,20 г яичногоальбумина растворяют в 10 мл воды,добавляют 2 мл (2,08 г) глутароного дкальдегида. После 24 ч выдержкипри 20"С Отделяют избыток глутарового диальдегкда гельтфильтрацией насефадоксе 5-25, К 100 мл водногораствора активиронанного альбуминацобавляют 0,10 г целлюлазы, Через24 ч водный раствор препарата приГоден для ферметнтативного расщепления целлюлозы. Выход в пересчете нацеллюлазу и альбумин 100, Активность 132 от исходной,Определение акт,1 вности фермента.Активность целлюлаэы определяетВ по методу Мандельса-Вебера. С О Г) Т Н Е Т С Т В С. тп т О Л 1 Е Т О и у и Г) ) 1.я Н); а Э -Нан аКТКНттЭСТЬ ЙПРЕттЕЛЯЕТСЯ ПО КО -личеству редуцирующкх сахаров,Образующихся прк тгидро тг 1 зе 5 О г 1 г(О, 5 х О, 5 см) бумаги ттЖа(гпап 9 1в течение 1 ч прк 50 С в 0,05 нацетатном буфере (рВ 4,8),П р и м е р 2, 0,30 г молочногоальбумина растворяют 15 мл воды,добавляют 2,4 мп (2,49 г) глутарового.диальдегкда. После 4 ч выдержки при +20 С отделяют избытокдкальдегида гель-фильтрацией на сефадексе Ь, К 130 мл водного раствора активкрованного альбумкна добавляют 0,20 г целлюлаэы, Через 24 чопределяют целлюлазную активность.ВЫХОД ПрЕПарата т,00. АКтИВНОСтЬ130,5 от актинностк ксходной целлюлазы.П р и м е р 3, 0,20 г бычьегосывороточного альбумина растворяютн 10 мп воды, добавляют 3 мл (3,12 г)глутарового дкальдегица, 11 оследующую обработку проводят аналогичноописанным примерам, К 108 мл водного раствора актквкронанного альбумина добавляют 0,06 г целлюлазы,Выход препарата 100. Активность134 от активности исходной целлюпазы,П р к м е р 4, 0,15 г яичногоальбумина растворяют в 7,5 мл воды,добавляют 3,12 г глутароного диальдегица. После 24 в часов выдержкипри +20 С отделяют избыток глутауоного дкальдегкда гельфильтрациейна сефадексе С,-25, Методом Оксимирования Определяют содержание альдегкда н низкомолекулярной Фракции0,08 г. Для активации альбумина израсходовано 3,04 г альдегкда. К полученным после г льфкльтрацки 98 млводного раствора активированногоальбумина (0,15 г альбумкна : 3,04 гцкальдегкда : 1;20) добавляют 0,15 гцеллюлазы (целлюлаза: ат:ьбу;.н 1 н : 1:1)Через 24 ч определяют целлюлазнуюактивность модифицированного нодорастноримого целлюлазного препарата,Она равна 132 от активности ксходной целлюлаэыВыход нодорастворкмого препаратав пересчете на целлюлазу и альбУмин 100,П р и м е р 5. 0,10 г молочногоальбумина растворяют в 5 мл водыдобавляют 2,6 г глутарового диальдегира. После 24-часовой выдержки, гельфильтрацией на сефадексе6-25 отделяют непрксоедкненный диальдегид. К 86 мп раствора акткнкрованного альбумина (альбумин: диальдегид - 1:25) добавляют 0,05 гцеллюлазы (соотношение целлюлаэа:альбумин : 1:2), Через 24 ч целлюлаэная активность составляет 138От тэ 1 ГТИВНОСТИ ИСХОДНОЙ ЦЕЛЛЮЛаЗЫ,709631 Формула изобретения Составитель ОСкородумоваРедакто Л. Емельянова Тех е Н,Бабурка Кор)спектор М. Пожо Заказ 8699/31 Тираж 495ЦНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытийму ю . . Подписное жгород, ул. Проектная илиал П те Выход яорастворнмого целлюлаз ного преэрата 100.П р и м е р 6. 0,30 г бычьего сывороточного альбумина растворяют в 15 мл воды, добавляют 2,7 г глутарового диальдегида. После 24- часовой выдержки, гельфильтрацией отделяют неприсоединенный диальдегид. К полученным 118 мл водного раствора активированного альбумина (альбумин; диальдегид 1:8) добавляют 0,1 г целлюлазы (целлюлаза:альбумин:1:3). Способ получения модифицированного водорастворимого препарата целлюлазы посредством ковалентногссвязывания целлюлаэы с полимером,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью увеличения выхода целевогопродукта, в качестве полимера используют альбумины, предварительноактивированные глутаровым диальдегидом при весовом соотношении альбумин:глутаровый диальдегид 1:8-25,а связывание целлюлазы с полимеромпроводят при весовом соотношениицеллюлаза: полимер 1:1-3 соответственно.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Патент СШь Р 3929574,кл, 195-66, опублик. 1975,2. Патент Великобритании 9 1290701,кл. С 3 Н, опублик. 1969 (прототип).