Способ получения гексокиназы

) Заявлено 05.07.76 Ф)присоединением заявки И С 12 Р 13/1 С 07 (т 7/03 асудврствакнмй квететВеветв Мкккстроа СССРаааалам юобрвтеейа еткрыткй риоритет(43) Опубликовано 25.10.77,Бюллетень 39 (45) Дата опубликования описания 10,11.77 УДК 577.15.663,(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕКСОКИНАЗЫ сификация ро 1 и увеличение ной цели перед о ивируют при аарадержащей фосфат в течение 1-3 ч,обавляют индукколичестве 10-,ц К Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способамполучения фермента гексокиназы, применяемого в молекулярной биологии и медицине,Известен способ получения гексокиназыиз хлвбопвкарных дрожжей, предусматриваюший плазмолиз дрожжей толуолом и осаждение фермента сульфатом аммония 1,При этом исходная активность гексокиназы в первоначальном экстракте исходной Обиомассы составляет 4 ед/мг б.елка. Активность гексокинаэы после осаждения супьфатом аммония равна 6 ед/мг белка,Однако активность гексокиназы зависитот активности гексокиназы в биомассе држжей.Цель изобретения - интен. цесса биосинтеза гексокиназактивности фермента.Даи достижения поставленплазмолиэом дрожжи культии на питательной среде соалия и сернокислый магнийзатем в питательную среду дтор гексокиназы- глюкозу в 15% и продолжают процесс в течение 0,8-1При атом фосфат калия вводят в растворв количестве 27% а сульфат магния -0,5 Ъ,Дрожжи культивируют при.30 С и рН 8-7.оПо предлагаемому способу перед вкстракцивй тоболом осуществляют культивирование исходкой биомассы дрожжей в растворе фосфата калия с добавлением солей магния при 30 С,рГ 5-7 и режиме аэрации 0,5-1 (воздух, культуральная жидкость) в течение1-3 ч, .затем добавляют индуктор гвксокина зы-глюкозу в концентрации 10-15% и процесс продолжают в течение 0,5-1 ч.При проведении .культивирования биомассы дрожжей с активностьк 0,78 вд/мг белка получают биомассу дрожжей с активностью 8,2 ед/мг белка.Повышение активности гексокиназы про.исходит эа счет культивирования исходнойбиомассы дрожжей. Культивирование исходной биомассы дрожжей проводят в двв стадии, На первой стадии введением фосфатакалия и солей магния происходит активацияферментных систем клетки в том числе ферментов цикла гликолиза. Это достигается577229 3путем частичного и обратимого блокированияокислительных железоферментов дрожжей, врезультате чего дыхание клетки частичнотормозится и поэтому активизируется анаробная фаза дыхания, На второй стадии благодаря добавлению глюкозы в качестве индуктора активности гексокиназы в ферментационной среде осуществляется следующаяреакция:10Д-глюкоза+ АТФ гексокиназа Д-глюкоэо фосфат + АДФ.Таким образом по предлагаемому способупроводят вторичное культивирование исходного дрожжевого сырья. Биомассу дрожжей (500 г прессованных дрожжей на 1 лсреды) суспендируют в растворе фосфатакалия (2,7% КН Р 04) и солей магния (0,5%МЯ 5047 НО) и прй непрерывном перемешивании и аэрации культивируют 2-6 ч, оФТемпература культивирования от 25 до 32 С;рН среды 5,0-7,0, режим аарации 0,5;1(воздух: культуральная жидкость)Затем кферментационной среде добавляют глюкозув концентрациях 10-15%. Процесс культиви- урования продолжают еше 30-60 мин. Активность гексокиназы в биомассе дрожжейсоставляет 8,2 ед/мг белка. Дрожжи плазмолизируют толуолом и экстракт фракционируют сульфатом аммония, 30Предлагаемый способ иллюстрируется1 примерами его выполнения,П р и м е р 1. В качестве исходногосырьяиспользуют биомассу хлебопекарныхдрожжей 5 оссИа оеусеб се еч ь(а т ЗбПрессованные дрожжи в количестве 1 500 гс активностью гексокиназы 0,69 ед/мгбелка подвергают вторичному культивированию в реакторе емкостью 1 0,0 л. В первойстадии культивирования применяется следую 4 Ьщий состав питательной среды в г:81,0 КНР 04, 1.),ОМ 507 Н 0воды.Температура культивирования 30 С, Вреакторе в чер,з распределитель подают 45стерильный воздух в количестве 1,5 л/мин,Культуральную жидкость перемешивают соскоростью мешалки 600 об/мин.После 2 ч начинают вторую стадию культивирования биомассы дрожжей и в реактор Ждобавляют 300 г гшокозы. После атогопроцесс культивирования дрожжей при данном режиме продолжают 30 мин,Полученную биомассу дрожжей отделяютот культуральной жидкости на вакуумномфильтре. К онцентрация гексокиназы и биомассе составляет 8,2 ед/мг белка, В сравнении с исходным сырьем активность гексокинаэы повышается от 0,69 до 8,2 ед/мгбелка. 60 Дрожжи плаэмолнэируют толуолом и аксътракт фракционируют сульфатом аммония. Получают ферментативную активность гексо. кинаэы 14,2 ед/мг белка,П р и м е р 2, В качестве исходного сырья используют биомассу спиртных дрожжей,5 ассЬа обрусев се"Еюва 1Прессованные дрожжи в количеств 1 500 г с активностью гексокинаэы 0,75 ед/ мг белка подвергают культивированию в реакторе емкостью 10 л. В первой стадии культивйрованияприменяется следующий состав питательной среды-в г: -81 0 КН РО, 15 О Мф 5 Од. 7 Ну 0 1,5 л вода. оТемпература культивирования 30 С, В растворе через распределитель подают стерильный воздух в количестве 1,5 л/мин. Культуральную жидкость перемешивают со скоростью мешалки 1 200 об/мин. После 3 ч начинают вторую стадию культивирования биомассы дрожжей и в реактор добавляют 450 г глюкозы. После чего процесс культивирования дрожжей продолжают 1 ч,Полученную биомассу дрожжей отделяют от культуральной жидкости на вакуумном фильтре, Концентрация гексокиназы в биомасс 1 составляет 7,9 ед/мг белка. Гексокиазу из биомассы дрожжей выделяют как в примерв 1,Предложенный способ обеспечивает повышение активности гексокиназы в биомассе дрожжей до 7,9- 8,2 ед/мг белка,В сравнении с исходным сырьем активностьповышается от 0,69 ед/мг белка до 8,2 ед/мгбелка и от 0,75 ед/мг белка до 7,9 ед/мгбелка,ф ормула изобре те ния 1, Способ получения гексокиназы из биомассы дрожжей; предусматривающий плаэмолиз дрожжей толуолом и осаждение фермента сульфатом аммония, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью интенсификации процесса биосинтеэа гексокнназы и увеличенияактивности фермента, перед плазмолизомдрожжи культивируют при аарации на питательной среде, содержашей фосфат калияи сернокислый магний в течение 1-3 ч,затем в питательную среду добавляют индуктор гексокинаэы - глюкозув количестве10-15% и продолжают процесс в течение0,5-1 ч,2. Способ по п, 1, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что фосфат калия вводят в раст577229 Составитель Т;СеребренниковаРедактор Р. Пурнам ехред Н. Бабурка Корректор С. П Заказ 3543/20 Тираж 541 ПодписноеЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва Ж-.35,Раушская нвб., д, 4/5 Филиал ППП Патент, г, Ужгород, ул. Проектная 4 вор вколичестве. 27%, а сульфат магния -05%.3 Способ по и 1 о т л и ч а ю ш и Йс я тем, что дрожжи культивируют при30 С и рН 5-7. Источники информации принятые во вннмание при акспертизе: 1. АииаРз М.Э.Асслл 4 а иу аЕ 5 леисеб,5 1968, 151, 1, 307.