Способ получения антибиотика сисомицина

ОЛ ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯИ ПАТЕНТУ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик(31) 740742 (33 27,06.68 Гесударствевей комитет Совета Мииаетрев ССР ве делам иаебретееий и еткрытий1) Заявите СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОП 4 КА СИСОЫИЦИНА ретенне к произв длагаемь ре ие опи имени Способ щей форм ИОСц ОН НеМН е1 Э 3292 Мегоео-. тствукмций ему логических и ости продуциро В Водной пита- що ки углерода,0-40 С нмм йймм, соог кроморфо лючается в том, что нпа рога 1 пдоема илн нтта тношентги основных ми зиологических своиств ть иеяевсй продукт, вы де, содержа неральиые с лают целе виде продук де гидратови снособнраптиваюттлей источни тельнойазота и ми6,8 - 80 и вьтпевиде нли втом,или в ви ли п он продукт в свободном та конденсации с альдегиэвестными приемамн.(43) Опубликовано 25.05,77 (45) Дата оп.убликовайия тносится к области медицины, адству антибиотиков, способ получения антибиотика в ния антибиотика снсомицина об. 2Полученный анщбиощк оказывает отрицательное влияние на рост грамм положительных и осо.бенно грамьеотрицательных бактерий и можетбыть также кснользован в виде различных,функ.цнональных производных.И 1 тамм Ийй 1. ЗЮ 2 выделен из образца почвыНационального леса Инно в Калифорнии. Послеивкубацин штамма в течение 14 суток при 24 - 26 Сна агаровой среде, содержащей 3% амина типа А,10% декстрозы и 1,5% агар - агара, наблюдается ростот удовлетворительного до плохого. Невооружен.иым глазом воздушный ьвтцелш установить нельзя.Иногда появляются несколько хороню развитыхколоний в обласщ инокуляции. На некоторыхчащках иаблюдатат слабый красновато - коричневыйдиффунднрувнпий пигмент, связанный с коло.татями. Цвет поверхносщ колоний от краснокоричневого до темно - коричневого, Методом а.зового контраста можно установить, что ьвцелийявляется длинным, разветвленным, регулярным ине разделенным поперечными перегородками,Диаметр мицелия приблизительно 0,5 мкм. Простые спороформы имеют по одной споре диаметоом1,0-1,5 мкм.Стенки спор шероховатые от яйцевю.ной до сферической формы.51 О 29 25 35 о 45 50 55 60 30 3Штамм хорошо растет при 28-37 С, При темпе.ратуре 50 С никакого роста не наблюдается. Насреде из глюкозы и аспаргинового агара рост ока.зывается плохим. Растущая колония штвмма гидро.лизует желатину, молоко, крахмал и восстанавливает нитрат натрия.П р и м е р 1, В колбу со 100 мл питательнойсреды, содержащей, г/л: 8 мясного экстракта, 5триптона 5 дрожжевого экстракта, 1 декстроэы, 24крахмала и 2 карбоната кальция, вносят лиофильновысушенную культуру штамма или кретки, полученные иэ скошенной культуры, и выращивают 5суток при 35 С на вращаыцемся вибраторе, 25 млкультуральной жидкости, полученной на этой стадии,вносят в колбу с 500 мл питательной среды того жесостава и выращивают 3 суток нри 28 С на вращающемся вибраторе.В сосуц емкостью 14 л вносят 500 "л культуральной жидкости, полученной на второй стадии, и9,5 л питательной среды, содержащей 50 г/л декстрина, 5 г/л декстрозы, 35 г/л соевой муки, 7 г/лкарбоната кальция, 10 моль/л хлористого кобальтаи 10 мл пеногасителя. Значение рН среды устанавливают на уровне 8 и осуществляют культивирование в течение 66 - 90 час при перемешивании(250 об/мин) и аэрации (4,5 л/мин при 22,5 атм) .Полученную культуральную жидкость подкисляютбн серной кислотой до рН 2 и оставляют длядальнейшей обработки.170 л подкисленной кулыуральной жидкостифильтруют, промывая мицелий водой, и добавляютиивелевую кислоту, осаждают кальциевые соединеьия, выпавший осадок отфильтровывают, а фильтрат нейтрализуют аммиачной водой и пропускаютчерез колонку с 1500 - 2000 г катионита (амберлитРС) в аммонийной форме. Смолу промываютводой и элюируют 2 н раствором аммиака, собираяфракции по 400 мл. Активные фракции объединяют, упаривают в вакууме досуха и получают 28 гсырого антибиотика с активностью 500 мкг/мгДля очистки 28 г сырого антибиотика раство.ряют 100 мл дистиллированной волы и пропускаютчерез колонку с анионитом,Элюцию производят дистиллированной водой,собирая фракции по 00 мл. Активные фракциилиофильно высушивают и получают 5,7 г антибиотика с активностью 900 мкг/кг.Для получения сернокислой соли 3,9 г основа.ния антибиотика, полученного как это описановьпце, растворяют в 60 мл воды и доводят значениерН до 4,5 добавлением 6 н. серной кислоты, Растворобрабатывают актнвированным углем, фильтруют иосаждают препарат добавлением 1 л метанола,После фильтрования и высушивачия получают 4,8 г сернокислпй соли антибиотика с активностью 640 мкг/кг.П р и м е р 2. 200 г порошка целлюлозы типаУотман г смешивают с 20 мл растворителяхлороформ /мстанпл/ 7" -ная гидроокнсь аммония (2: 1: 1) и ползал в кплппки диаметром 6,36 мм 4н высотой 508 мм, Растворитель пропускают череколонку до появления желтой полосы примесей. 2сульфата антибиотика растворяют приблизительно в3 мл растворителя, смешивают с некоторым количеством порошка целлюлозы, высушивают под вакуумом и подают в верх колонки. Пропуская черезколонку со скоростью 1 мл вмин, собираютфракции по 5 мл через каждые 15 мин. Фракции1 - 180 соединяют, выпаривают, вновь растворяютв воде и пропускают через 18 А 4 О 8 анионообменную смолу в гидроксильном виде. Серной кислотойзначение рН злюата устанавливают на 4,5, растворобрабатываю углем, фильтруют и концентрируют,в концентрат добавляют избыток метанола, образовавшийся белый осадок отделяют фильтрованием.Осадок растворяют в воде, раствор пропускаютчерез колонку иэ смолы типа 1 ЯА 4013 в гидроксильной форме, Вытекающий поток собирают,концентрируют, подвергают лиофильной сушке иполучают приблизительно 300 мг антибиотика ввиде основания с активностью 1000 мкг/мг.П р и м е р 3. 104,7 г антибиотика в видеоснования растворяют в 4 мл воды, хлористоводо.родной кислотой значение рН раствора устанавли.вают на 4,5. Раствор выпаривают, остаток растворяют в метаноле. К раствору добавляют избыточноеколичество ацетона, выпавший осадок отфилыровывают и получают 130 мг гидрохлорида антибиотика активностью 753 мкг/мг,П р и м е р 4 Приготовление кристалличес.кого моногидрата антибиотика. Готовят хромато.графическую колонку иэ геля двуокиси кремния,используя в качестве растворителя смесь иэопропа.нол /СНО,/ гидроокись аммония (1:2:),1 г антибиотика в виде основания растворяют в5,0 мл растворителя, адсорбируют фракции по5,0 мл и ппрецеляют расположение фракций тонко.слойной хроматографией на плитах из геля двуоки.си кремния. Подходящие фракции (44 - 78) соединяют и выпаривают под вакуумом, при этом получа ют светло - желтую жидкость, которую путемаэеотропной дистилляюи с зтанолом кристаллизуют в светло - желтые розетты, Полученный про.дукт представляет собой моногидрат антибиотика.Т.пл, около 180- 85 С; выход 650 мг,П р и м е р 5. 11 олучение продукта конденсацииантибиотика с бензальдегилом,5,0 г антибиотика в 60 мл абсолютного этанолаобрабатывают 5,9 г бензальдегида, репиркулнруют втечение 1 час, Раствор охлаждают и филыруют, получают7,0 г белого кристаллического вещества, т.пл.23.126 С,Ма , =+43,2, концентрация 0,3;: в СНСз, Элементарный анализ показывает лять бепэзльдегидныхостатков.Аналогично замещая бензальдегидный реагентэквивалентным количеством одного из следующихаллегидов: ацетальдегил, фурфурол, пиклопентал.ацеталыю ил, кросжиьлегид, салицнлальлегид, ва.линю, вера сральлегпд, псрплпксал. получаят соогвет.стниошие прод) к гы конденсации с альдегилэми.559658 Составитель С, МалютинаТехред я. Лндрейчук Корректор М. немчик Редактор Л. Бер Тираж 541 Подписное БНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений н открытий 113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб.л.4/5Способ получения антибиотика сисомицнна, о тли ча ющий ся тем, что штаммкультуры 1 чВВ 1.со 3292 Мягогпоповрога 1 пдоепвЬ или мутант, соответствующий ему в отношении основных микроморфологических и физиологических свойств н способности продуцировать целевой продукт, выращивя.ют в водной питательной среде, содержац 1 ей источ.ники углерода, азота и минеральные соли, при20.40 С и рН 6,8.8,0 и выделяют целевой продукт всвободном виде или в виде продукта конденсациис альдегидом, или в виде гидратов известнымиприемами,