Способ очистки -аспарагиназы

О П И С А Й И Е 0) 459475ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ союз Советских Сониалистическнх Республик(22) Заявлено 27,07,73 1952276/28 ис присоединением за Государственный комитет Совета Министров СССР ло делам изобретенийи открытий(О Дата опубликования описания 22.0(7) Заявптел сесою исти вательскии ых веществ 54) СПОСОБ ОЧИСТКИ 1.-АСПАРАГИНАЗЬ фракционирование органичеем проводить при темпераадок растворять в буфере Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано в производстве ферментов из микроорганизмов, как способ очистки фермента 1.-аспарагиназы, выделенной из клеток Езс 1 тегсЫа со 1.Известен способ очистки 1.-аспарагиназы по основному авт. св.436085, по которому биомассу ЕзсЬег 1 сЫа со 11 в виде ацетонового порошка, содержащую 1.-аспарагиназу, обрабатывают водой при 37, подкисляют, центрифугируют, осадок отбрасывают, а к раствору, содержащему фермент, добавляют сульфат аммония до 50% от насыщения и нагревают 30 мин до 55, центрифугируют, осадок отбрасывают, а к раствору, содержащему фермент, повторно добавляют сульфат аммония до полного насыщения. Выпавший осадок содержит частично очищенную 1.-аспарагиназу.С целью получения более очищенной 1.-аспарагиназы предложено после фракционного осаждения 1.-аспарагиназы сульфатом аммония полученный осадок растворять в буферном растворе в присутствии стабилизатора и осуществлять многократное фракционирование органическим растворителем, преимущественно этанолом.Целесообразноским растворителтуре 20 - 30 С, ос например в трис-буфере, рН 8,5, содержащем в качестве стабилизатора 0,01 М раствор 1.-аспарагина и отделение сульфата аммония проводить лишь после повторных фракциони рований органическим растворителем. Для отделения фермента 1.-аспарагиназы от низко- молекулярных веществ можно использовать хроматографию, например, через сефадекс б - 25.0 Способ состоит,в следующем. Очистку 1.- аопарагиназы ведут по известному способу до получения частично очищенного препарата, содержащего остатки сульфата аммония, способного стабилизировать 1.-аспарагиназу. Да лее без предварительного удаления сульфатааммония очистку 1.-аспарагиназы проводят методом спиртового фракционирования.Для осаждения 1.-аспарагиназы применяютдостаточно высокую концентрацию спирта, 20 получающуюся при добавлении 1,5 - 2,5 объемов (предпочтительно 2 объема) наобъем раствора фермента, т. е. составляющую в итоге 55 - 62%.Для повышения степени очистки 1.-аспара гиназы фракционирование спиртом проводятпри повышенной температуре (20 - 30 С). Для увеличения выхода путем предотвращения денатурации фермента необходимо добавлять дополнительно стабилизатор 1.-аспарагин.30 Повышение температуры на стадии спирто45 М 75 Таблица Способ очистки 1.-аспарагиназы в единой технологической схеме Удельная активность,ме/мг белкаТехнологические операции Обработка отмытых водой клеток Е.со 11 ацетоном и отделение ацетонаВысушивание ацетонового порошка Е. со 11 Экстракция в воду Комнатная То же100 0,5 - 1,5 37 С,2 - 4 час Комнатная Подкисление до рН 4,3 - 4,6Отделение ферментного экстракта от биомассыЕ,со 1Нагревание с (ИН,)яЯО, (45 - 50;4) 3 - 5 80 То же 55 С,0,5 час Отделение ферментного раствора от осадкаденатурированных белковОсаждение фермента с (тчН,)804 (85 - 90;4) Комнатная 10 С,10 - 12 час Отделение осадка с 1.-аспарагиназой и егорастворение в буфереПервое фракционирование этанолом с двумяцентрифугированиями и растворениемВторое фракционирование этанолом в тех жеусловияхОбессоливание на сефадексе О - 25Лиофилизация 10 - 20 60 - 100 55 Комнатная 50 20 - 3020 - 30Комнатная 120 в 1 120 в 1 120 в 1 45 45 40 Замороженное состояниебелков отделяют фильтрованием через склад.5 чатый бумажный фильтр (или центрифугированием 15 мин при 6000 об/мин). К суперна.танту добавляют сульфат аммония до 90% насыщения (400 г соли на 1 л жидкости) и ос.тавляют стоять в холодильнике на ночь, после 10 чего центрифугируют. Осадок, содержащий1.-аспарагиназу, вместе с остатками раство.ра сульфата аммония растворяют в 60 мл трис-буфера, рН 8,5, содержащего 0,01 М 1.-аспарагина, К раствору добавляют,при ком натной температуре два объема спирта (концентрация, не ниже 98%), осадок отделяют центрифугированием и растворяют при комнатной температуре в 16 мл трис-буфера, рН 85, содержащего 0,01 М 1.-аспарагина, 20 Нерастворившуюся часть балластных белков отделяют центрифугированием. К супернатанту повторно добавляют два объема спирта при комнатной температуре, осадок собирают центрифугированием и растворяют в 25 12 мл трис-буфера, рН 8,5, содержащего1.-аспарагин при комнатной температуре. Не- растворившуюся часть балластных белков по. вого фракционирования влияет на качество получаемого продукта, так как удельная активность 1.-аспарагиназы, полученной на стаПример 1. Культуру Е. со 11 В 318 выращивают в ферментере емкостью 250 л на среде с 5% кукурузного экстракта с добавлением солей в течение 10 час с аэрацией и перемешиванием при рН 7,0 - 7,2, после биомассу отделяют центрифугированием, промывают водой, обрабатывают ацетоном при,комнатной температуре и высушивают, получают сухой ацетоновый порошок Е, со 11, содержащий 1.-аспарагиназу, 50 г ацетонового порошка Е. со 11 размешивают в 1 л дистиллированной воды и оставляют стоять при 37 С в течение 2 час. Далее к экстракту при комнатной температуре добавляют 1,0 М раствор уксусной кислоты до рН 4,5, скоагулированный осадок отделяют центрифугированием (15 мин при 6000 об/мин) и отбрасывают.К супернатанту, являющемуся подкисленным водным экстрактом 1.-аспарагиназы, добавляют сульфат аммония до 50% от насыщения (275 г соли на 950 мл экстракта), Раствор помещают в водяную баню на 30 мин при 55 С, охлаждают до комнаТной температуры и скоагулированный осадок денатурированных дии спиртового осаждения при 20 - 30 С, в5 - 10 раз больше той, которая получается наэтой стадии при 4 - 5 С.459475 Предмет изобретения Составитель В. Максимов Техред А, Камышникова Корректор В. Брыксина Редактор В. Смирягина Заказ 678/18 Изд.335 Тираж 529 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Типография, пр. Сапчнова, 2 вторно отделяют центрифугированием. Раствор с 1.-аспарагиназой пропускают через колонку с сефадексом б - 25 (2,2 К 38 см), собирают белковую фракцию и лиофилизируют. Полученная 1.-аспарагиназа представляет собой белый порошок, хорошо растворимый в буферах, рН около 8. Удельная активность 130 - 150 ме/мг белка, общий выход в расчете на биомассу около 40%П р и м е р 2. Препарат, полученный по примеру 1, до обессоливания и лиофилизации осаждают при комнатной температуре одним объемом спирта и ставят на несколько дней ,в морозильник. При этом образуются кристаллы 1-аспарагиназы и сульфата аммония. Кристаллы отделяют центрифугированием и далее обрабатывают как в примере 1 после спиртового осаждения. Удельная активность 180 ме/мг белка, выход 60 - 80%. Чистоту полученного таким образом препарата аспарагиназы контролируют электрофорезом в,полиакриламидном геле, получают 1 полосу, что указывает на гомогенность белка.Активность определяют инкубацией фермента с 1.-аспарагином в трис-буфере, рН 8,5 по освобождающемуся аммиаку методом несслеризации. Для освобождения фермента от стабилизаторов (сульфата аммония и 1.-аспарагина) раствор перед определением активности обессоливают на сефадексе 6 - 25. Активность выражают в ме/мг белка (1 ме - соответствует 1 микромолю продукта, образовавшегося при инкубации в течение 1 мин при 37 С). Белок определяют по Лоури, причем перед определением раствор очищают полностью от сульфата аммония.5 1. Способ очистки 1.-аспарагиназы по авт.св. Мз 436085, отл и ча ю щи й с я тем, что, с 10 целью получения более очищенной .-аспарагиназы, после фракционного осаждения 1.-аспарагиназы сульфатом аммония, полученный осадок растворяют в буферном растворе в присутствии стабилизатора и осуществляют 15 многократное фракционирование органическим растворителем, преимущественно этанолом.2, Способ по п. 1, отличающийся тем,что фракционирование органическим раство рителем осущетвляют при 20 - 30 С,3. Способ по пп. 1 - 2, отличающийсятем, что в качестве буферного раствора используют трис-буфер при рН 8,5.4. Способ по пп. 1 - 3, о т л и ч а ю щ и й с я 25 тем, что при растворении осадка в качествестабилизатора используют 0,01 М раствор 1.-аспарагина.5. Способ по пп. 1 - 4, отличающийсятем, что после фракционирования органиче ским растворителем осадок растворяют ипропускают через хроматографическую,колонку, например сефадекс б - 25.