Способ определения состава изолированных клеток на гистологическом препарате

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советских Социалистических Республик(22) Заявлено 250777 (21) 25104 37/28-13с присоединением заявки Нов(5)м )( 3 6 01 й 33/00 Государственный комитет СССР ио делам изобретений н открытийДата опубликования описания 23. 12. 80(72) Авторы изобретения Б.Н.Кудрявцев, М.В.Кудрявцева, Е,Э.Завадскаяи Т.М.Шалахметова Институт цитологии Академии наук СССР(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОСТАВА ИЗОЛИРОВАННЫХ КЛЕТОК НА ГИСТОЛОГИЧЕСКОМ ПРЕПАРАТЕ Изобретение относится.к цитологи и может быть использовано в цитохимии для количественной оценки содержания компонентов клетки.Известен способ определения состава изолированных клеток на гистологическом препарате путем введения меченого предшественника ДНК; скрашивания по Фельгену, нанесения фотоэмульсии, подсчета меченой ДНК и ее цитофотометрии 11.Однако известный способ не позволяет точно определить состав изолированных клеток на одном препарате.Цель изобретения - повышение точности способа эа счет определения состава изолированных клеток на одном препарате.та цель достигается тем, что до опрашивания по Фельгену ставят РА 5- ,реакцию и определяют содержание гликогена, после чего препарат обрабатывают 0,020-0,025 борогидридом натрия в течение от 20 до 30 мин при температуре от 2 до 5 С,Способ осуществляют следующим образом.Вначале на предметном стекле приготавливают препарат-мазок изолированных клеток (например, для приготовления мазков изолированныхклеток печени используют следующуюметодику: после декапитации животного печень перфузируют в течение 5 10 минут смесью равных объемов фосфатного буфера (рН=8,0) и 5-го раствора сахароэы, измельченные кусочки печени помещают на 8 мин вфосфатный буфер (рН=7,3) и затем 10 приготавливают мазки от животного,которому предварительно вводят меченый предшественник ДНК ЗН-тимидин (иэ расчета 1 микрокюри на граммвеса животного) и фиксируют его метанолом. Затем на препарате выбирают неподвижные клетки на основе морфологических критериев и картируют препарат, т.е. замечают на немположение каждой выбранной клетки 2 О и нумеруют ее. После этого предметное стекло покрывают покровным, используя при этом в качестве заключающей среды глицерин, и измеряютсухой вес отмеченных клеток с по мощью интерференционнного микроскопа. Снимают покровное стекло, спомощью этанола удаляют глицерин,проводят флуоресцентную" РА 5-реакциют.е. оксление клеток периодатом ка- ЗО лия (0,8-ый раствор К 0 на 0,3-оИ-Н-Т - клетки, не включившие Н-тимидин Формула изобретения азотной кислоте, рН=2,2, температура комнатная, продолжительностьокисления 90 мин) и окрашивание ихзатем реактивом типа ШНффа аурамином(свежеприготовленный 0,3-ныйводный раствор аурамина 0 + 0,2 млхлористого тионила) в течение 90 минпри комнатной температуре (5-7 о)заключают препарат в вазелиновое масло и измеряют содержание гликогена в тех же клетках с помощью цитофлуориметра. Снимают покровное стекло, с помощью этанола или ксилолаудаляют с препарата вазелиновоемасло и обрабатывают его 0,025-нымводным раствором борогидрида натрияв течение 30 мин при температуре2-5 ОС. Такая обработка приводит кполному удалению положительной РА 5 реакции в клетках и блокированиюальдегидных групп гликогена, образовавшихся ранее при окислении препарата периодатом, содержание ДНК приэтой обработке не затрагивается.Споласкивают препарат в 3-х сменахдистиллированной воды (по 1 мин, вкаждой), вновь фиксируют его метанолом и высушивают на воздухе. Окрашивают препарат на ДНК с помощьюобычной или "флуоресцентной" реакцииФельгена, т.е. проводят гидролиэпрепарата в соляной кислоте (напримербИНС в течение 8-10 мин при комнатной температуре), окрашивают егосоответственно обычным реактивомШиффа или реактивом типа Шиффа аураПредлагаемый способ обеспечивает высокую точность за,счет определения состава изолированных клеток на одном препарате он позволяет исследовать заА номерности соотношения содержания гликогена . и сухого веса в популяциях различных типов клеток, в частности в клетках к раэличйой степени плоидности, клетках, находящихся на разных стадиях митотического цикла. Предлагаемый способ может быть использован не только в теоретических работах, но и непосредственно в медицинской практике, где на диопсийном или хирургимином - 50 (свежеприготовленный0,3-ый водный раствор аурамина0 + 0,2 мл хлористого тионила,температуре 2,5 ОС) в течение 90 мин, дифференцируют в сернистых водах и спиртах возрастающей крепости, высушивают на воздухе и заключают в вазелиновое масло, Содержание ДНК в отмеченных клетках, окрашенных с помощью обычной реакции Фельгена,измеряют на абсорбциойном цитофотометре, а окрашенных с помощью "флуоресцентной" реакции Фельгена нацитофлуориметре. Снимают покровноестекло, удаляют с препарата вазелиновое масло с помощью этанола или 15 ксилола, обычным способом наносятфотоэмульсию на препарат, экспонируют его и затем определяют число зерен серебра над ядрами тех же клетоквизуально или с помощью подходящей Щ аппаратуры. В результате проведения всех операций достигается точное определение в клетке каждого компонента, В качестве примера применения предлагаемого способа приводят результаты определения содержания гликогена и сухого веса в синтезирующих и несентеэирующих ДНК гепатоцитах крысы различной плоидности. Распределение клеток по содержанию ДНК следующее: диплоидные - 4,9, тетраплоидные 85,8, октаплоидные - 9,3. Данные сведены в таблицу. ческом материале можно исследовать соотношение содержания гликогена и сухого веса в клетках различной плоидности для диагностических целей. При этом содержание гликогена и сухой вес могут быть измерены даже в популяциях, которые содержат 1-5клеток с данной степенью плоидности.60 Способ определения состава изо 65 лированных клеток на гистологичес789747 Составитель С.МалютинаРедактор А.СУдын Техред,Е,Гаврилешко Корректор: Ю,Макаренко Заказ 9025/38 Тираж 1019 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035,Москва,Ж,Раушская наб.,д.4/5Филиал ППП "Патент". д. Ужгород,ул. Проектная,4 ком препарате путем введения меченого предшественника ДНК, скрашивания по Фельгену, Йанесенияфотоэмульсии, подсчета меченой ДНК и еецитофотометрии, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышенияточности способа эа счет определения состава изолированных клетокна одном препарате, до окрашиванияпо Фельгену ставят РА 5-реакцию иопределяют содержание гликогена,после чего препарат обрабатывают 0,0200,025 борогидридом натрия в течение от 20 до 30 минут при температуре от 2 до 5 С.: Источники информации,5принятые во внимание при экспертизе1. Папаян Г.В.,Агроскин Л.С.,Бродский В.Я., Раутиан Л.П. Одновременное измерение количества вещества и интенсивности метки наокрашенных автографах.-"Цитология",1973,15,9, с. 1184-1190.