389446

О П И С А Н И Е 389446ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик ое от авт, свидетельстваЗа М. Кл. 6 01 п 21 А 231 1(Заявлено 26,Х 1.1971 ( 1719429/30-15) соединением заявкиасударственныи комитетСавета Министрав СССРпа делам изобретенийи аткрытий ПриоритетОпубликовано 05.Н.1973. Бюллетень2Дата опубликования описания 20.Х 1.1973 УДК 543 636 085(088 8 И 3 ЮРШб Автор изобретения Н, Леоно есоюзный научно-исследовательский институт ветеринарнойсанитарии аявитель ОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ МИК СИНОВ В КОРМА Изобретениекологических д Р зернофуража.Известен способ обнаружения в кормах токсических веществ, включающий получение фракций, содержащих зеараленон, афлатоксин и охратоксин, из хлороформенного экстракта исследуемого образца путем его обезжиривания гексаном и бензолом с последующей промывкой экстракта на колонке, содержащей силикагель, тремя соответствующими системами растворителей и определение этих трех веществ с помощью тонкослойной хроматографии. Однако этот способ позволяет обнаружить лишь некоторые микотоксины.Предлагаемый способ увеличивает количество определяемых групп микотоксинов, Это достигается тем, что после обезжиривания гексаном хлороформенный экстракт элюируют этилацетатом и в полученном элюате определяют микотоксины из группы диацетоксисцирпенолов.Кроме того, гексановый и бензольный алюат, содержащие жировую фракцию, выпаривают до полного удаления растворителя и исследуют на наличие жирорастворимых микотоксинов, например комплекса фузариогенинов (поэфузариогенина и спорифузариогенина), представляющих собой вещества из группы стеролов циклопентафенантренового ряда, имеющие шестичленное ла кто новое кольцо с двумя двойными связями в положении а - Р, у - д, путем обработки части полу ченных жиров щелочью до получения однородной эмульсии в присутствии небольших количеств обезвоженного диэтилового эфира.Наличие в жировой фракции фузариогенинов, реагирующих со щелочью, ведет к образова нию смолообразных продуктов конденсации,нерастворимых в щелочном растворе и эфире, что вызывает образование темного слоя на границе раздела этих двух фаз (эфир: щелочь). Наличие такого слоя свидетельствует 15 о том, что исследуемая проба содержит фузариогенины, а отношение его объема к объему исследованного жира позволяет судить об их количестве. Эту же жировую фракцию проверяют на содержание ряда 20 других микотоксинов, которые могут в нейсодержаться, т. е. определяют в масле кислотное число, стойкость водномасляной эмульсии и проводят с экстрагированными жирами ряд микрохимических реакций, ха рактеризующих их доброкачественность.Способ осуществляют следующим образом.Берут определенную навеску зерна (дерти,комбикорма), высушенного до воздушносухого состояния, измельченного и просеянного 30 через две пары сит для получения однород 38944660 65 ной фракции частиц, и экстрагируют эту навеску, увлажненную половинным по весу объемом дистиллированной воды, химически чистым хлороформом (десятикратным объемом по отношению к объему воды) в присутствии диатомовой земли (/, по весу от веса исследуемого образца). Экстрагирование ведут 30 мин в плотно закрытом сосуде, или в течение меньшего времени в скоростном блендоре (мацераторе), Полученный экстракт отфильтровывают через бумажный фильтр под слабым разряжением, или без такового, и часть получаемого фильтрата (0,2 от объема хлороформа использовавшегося для экстр акции) переносят на хроматографическую колонку, последовательно заполненную обезвоженным сульфатом натрия и силикагелем в соотношении: Ма 504 . силикагель: : Иа,504 (5:10:15), таким образом, чтобы общий вес веществ, наполняющих колонку, составлял половину от веса взятой для исследования пробы продукта. (Силикагель должен иметь размер частиц 0,05 - 0,2 лм и активирован 1 час при 105 в 1 С перед внесением в колонку). Исследуемый хлороформенный фильтрат на колонку переносят с помощью трехкратного объема гексана. Элюирование гексаном жировой фракции проводят со скоростью 10 - 20 мл/мин, Полученный элюат (1) отбирают и выпаривают для получения жира, с которым затем проводят микрохимические реакции. Промывают колонку гексаном, а затем таким же количеством этилацетата и полученную фракцию (11) сохраняют для определения в ней токсинов диацетоксисцирпенола и родственных ему веществ, образуемых грибами Р. 1 г 1 с 1 пе 1 цгп Р. эрого 1 г 1 сЫе 11 а и некоторыми другими. Продолжают промывать колонку бензолом и отобранную фракцию (П 1) сохраняют для проведения микрохимических исследований, Промывают колонку системой растворителей ацетон: бензол (9: 95 по объему), общий объем которой составляет пятикратный объем первоначально внесенного на колонку хлороформенного экстракта, и отбирают фракцию (17), содержащую зеараленон, Колонку промывают трехкратным по отношению к первоначальному хлороформенному объему количеством безводного диэтилового эфира и выпаривают его. В том случае, если после выпаривания получен жир (У), исследуют его микрохимически, Элюируют фракцию (У 1), в которой далее определяют афлатоксин, трехкратным объемом системы хлороформ - метанол (97: 3 по объему), Фракцию (711) элюируют с помощью пятикратного объема системы бензол: ледяная уксусная кислота (1: 9 по объему). В полученном элюате определяют охратоксин. Выпаривают полученные фракции (1 У и 71) до сиропообразной консистенции, а фракцию (71) - досуха в роторном испарителе, избегая сильного нагревания. Хлороформом переносят все три остатка в пробирки с при 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 тертыми пробками, выпаривают растворитель в токе азота и хранят полученные вещества для тонкослойной хроматографии определения зеараленона, афлатоксина и охратоксина, т. е, подвергают разделению фракции в тонком слое силикагеля при наличии на пластинках вещества - свидетеля в системах растворителей:Для фракции (17) - бензол: уксусная кислота (9: 1) и этанол: хлороформ (5: 95) при объеме пробы, наносимой на пластинку, 10 лкл от 0,5 мл бензола, в котором растворен сухой остаток.Для фракции (71) - хлороформ; ацетон (9: 1), при том же объеме наносимой на пластинку пробе,Для фракции (И 1) - бензол: уксусная кислота (9: 1) и толуол: этилацетат: форм- амид (5; 4:1) при тех же условиях.Проявление хроматографии производят с помощью длинного и короткого ультрафиолетового света с длиной волны порядка 366 и 254 нл, Для определения токсинов Г. 1 г 1 с 1 пе 1 шп полученную фракцию (П) осторожно выпаривают и наносят в этилацетате (10 мкл из 0,5 лл) на пластинку, и разделяют в системе этилацетат: толуол (3: 1). После подсушивания пластины ее опрыскивают концентрированной серной кислотой и нагревают при 125 С. Появляющиеся после такого проявления буровато-коричневые пятна, локали. зованные в зоне ЯР 0,2 - 0,25, как правило, свидетельствуют о наличии эфира 4-ацетамидо-гидрокси-бутеновой кислоты у-лактона, а зеленоватые или серовато-зеленые пятна, локализованные в зоне с Ю - 0,6, соответ. ствуют другому токсину Р. 1 г 1 с 1 пе 1 шп, а именно - 4 р, 15-диацетокси - 8 а- (3- метилбутирилокси)- 12,13 - эпокситризотец - 9-ен-За-ол (Т- токсин). Определение этих токсинов, как и определение токсинов, содержащихся во фракции 1 Ъ, У 1 и 711, желательно проводить в присутствии вещества - свидетеля.Масла, полученные в результате выпаривания гексановой промывки (фракции 1), используют для подтверждения наличия в исследуемом образце зерна токсических веществ, образуемых некоторыми грибами из рода Рцзаг 1 шп. Эти вещества, представляющие из себя стеролы циклопентафенантренового ряда с шестичленным лактоновым кольцом, реагируя со щелочами, способны образовывать нерастворимые в последних соединения. Поэтому при воздействии на водно- масляную эмульсию растворов щелочей на границе раздела фаз возникает темно-окрашенное кольцо. Эту микрохимическую реакцию проводят следующим образом. В пробирку с 0,1 - 0,2 лл масла, полученного в результате выпаривания гексанового элюата (фракция 1) и элюата, полученного после промывки диэтилового эфира (фракция 7), приливают 5 лл 2 н, КаОН и эмульгируют масло в щелочи. К щелочной эмульсии масла приливают небольшое (1 - 2 мл) количествоРедактор О, Филиппова Заказ 3005/8 Изд, М 800 Тираж 755 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Типография, пр. Сапунова, и диэтилового эфира. Появление бурого кольца на границе раздела двух фаз указывает на наличие в маслах упомянутых выше токсических стеролов. Этот же феномен, получаемый с маслами из фракции Ъ", свидетельствует о весьма значительном содержании в пробе кирорастворимых микотоксинов. Полученный результат может быть подтвержден постановкой кожной пробы на кролике с маслами, полученными из гексановой фракции (1),Масла, находящиеся в бензольном элюате (фракция 11), желательно использовать для определения кислотного числа. Для этого 0,1 - 0,2 г масла растворяют в этанольно-диэтилово-эфирной смеси (1: 1) и титруют 0,1 н, раствором едкого кали в присутствии фенолфталеина. Для вычисления кислотного числа количество (ял) щелочи умножают на ее титр и на 1000 (перевод в мг) и относят к навеске масла (в г). Кислотное число, превышающее 30, как правило, свидетельствует о недоброкачественности исследуемого зерна в санитарно-микологическом отношении. Предмет изобретения 1. Способ обнаружения микотоксинов вкормах, включающий получение фракций,содеркащих зеараленон, афлатоксин и охра- токсин, из хлороформенного экстракта исследуемого образца путем его обезжиривания гексаном и бензолом с последующей промыв кой экстракта на колонке, содержащей силикагель, тремя соответствующими системами растворителей и определение этих трех веществ с помощью тонкослойной хроматографии, отличающийся тем, что, с целью увели чения количества определяемых групп микотоксинов, после обезжиривания гексаном хлороформенный экстракт, внесенный в колонку, элюируют этилацетатом и в полученном эл вате определяют микотоксины из 15 группы диацетоксисцирпенолов.2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что, сцелью получения данных, косвенно свидетельствующих о наличии в исследуемом образце ряда микотоксинов неопределенной струк туры, масла, полученные в результате обезжиривания экстракта гексаном и бензолом, используют для постановки микрохимических реакций для выявления наличия в исследуемом образце токсических стеролов цикло пентафенантренового ряда, содержащих лактоновое кольцо, а также для определения кислотного числа, являющегося показателем качества исследуемого образца.