Способ консервирования тромбоцитов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 5)5 А 61 К 35/ Е ИЗОБРЕТЕНИ АВТОРСКО ИДЕТЕЛЬСТВ Постав в способе включающ защитной тор глице ции 5-7 ф 1,2-пропан моражива ростью 1ГОСУДАРСТВЕНЮЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССРГОСПАТЕНТ СССР)(71) Институт проблем криобиологии и криомедицины АН УССР(56) ВгоОтпаяеп О,А,. Агпттаде ЪЧ.,)., -ОгуоЫо)о 9 у, 1985, 22, 1, 1-9,(54) СПОСОБ КОНСЕРВИРОВАНИЯ ТРОБОЦИТОВ Изобретение относится к криобиологии, Известны способы консервирования тромбоцитов под защитой ДМСО и ДМАЦ,Однако ДМСО является токсичным, что требует его полного удаления из суспензии тромбоцитов после отогрева, в результате которого теряется дополнительно до 30)ь клеток, ухудшаются из функции. ДМАЦ не обеспечивает достаточной сохранности одной из основных функций тромбоцитов - гемостатической, что приводит к резкому снижению или полной потере их агрегационной активности.Известны способы консервирования тромбоцитов под защитой глицерина,Однако тромбоциты. консервированные этими способами, имеют низкий показатель реакции на гипотонический шок, (РГШ), который является важным показателем их функциональной полноценности, коррелирующим с приживаемостью.Источник литературы РГШ, )ь10 +3 15+ 416,26 +.2,03.,Ж , 1822782 Щ Изобретение относится к криобиологии. Цель изобретения - повышение морфо-функциональной сохранности тромбпцитов. Тромбоциты инкубируют в защитном растворе, содержащем аутоплаэму и криопротектор глицерин в концентрации 5-7,5)ь или 1,2 пропандиол в концентрации 2-3 )ь, после чего замораживают со скоростью 1- 2 О/мин до температуры кристаллизации защитной среды, далее со скоростью 0,4-0,6 /мин до -6 - -7"С, затем со скоростью 5-10/мин до -80 - -196 С,Наиболее близким к предлагаемому является способ консервирования тромбоцитов путем замораживания их со скоростью 37 град/мин до -196 С под защитой 0,5 М (4,6 ф,) глицерина и последующего отогрева на водяной бане при+37 С,Недостатком этого способа, как и всех остальных способов консервирования тром- боцитов под защитой глицерина, является снижение устойчивости тромбоцитов к гипотоническому шоку (18 + 2).Цель изобретения - повышение сохранности функциональной полноценности тромбоцитов за счет повышения их устойчивости к гипотоническому шоку. ленная цель достигается тем, что консервирования тромбоцитов, ем замораживание их до -196 С в среде, содержащей криопротекрин, глицерин берут концентраили используют криопротектор диол в концентрации 2-3)ь, а зание осуществляют сначала со ско- -2 град/мин до температуры55 кристаллизации защитной среды, Далее со скоростью 0,4-0,6 град/мин до (-6) - (-7) С и затем со скоростью 5-10 град/мин до (-80)- (-196) С.П р и м е р 1. Концентрат тромбоцитов получали методом диференцированного центрифугирования крови, заготовленной в пластикатные контейнеры "Гемакон". Из 500 мл крови получали один тромбоконцентрат (ТК), содержащий 0,6-0,8 10тромбоцитов в 20-25 мл плазмы. Непосредственно перез замораживанием готовили растоворы криопротекторов на аутологической плазме с рН 6,5. При необходимости объединяли 344 ТК от доноров, идентичных по группе крови и резус принадлежности. Перед замораживанием к суспензии ТК медленно, постоянно перемешивая, со скростью 0,3 мл/мин добавляли равный объем криопротектора глицерина или 1,2-пропандиола в разных концентрациях. Время экспозиции тромбоцитов в защитном растворе при 20- 22 С - 30 мин, Затем клеточную взвесь разливали в контейнеры и помещали в камеру программного охлаждения устройства УОП 6 6.000.000 производства ОП ИПКиК АН УССР. Замораживание осуществляли со скоростью 2,0" /мин до температуры замерзания защитного раствора, при которой инициировалось льдообраэование внеклеточной воды. с этого момента со скоростью 0,5/мин до -6 С, затем 7/мин до -196 С, погружали в жидкий азот. Отогрев производили в водяной бане при 37 С. Образцы из контейнеров переводили в пластикатные мешки, 30-40 мин термостатировали при 37 С, затем 10 мин центрифугировали, надосадок удаляли и к оставшимся тромбоцитам осторожно приливали аутологическую плазму с температурой 37 С,Для оценки сохранности гемостатической функции деконсервированных тромбоцитом исследовали их агрегационную активность под воздействием АДФ, реакцию на гипотонический шок и ретрактильную активность. В каждом опыте проводили 5 повторов, в которых анализировали по 7 контейнеров. Статистическую обработку проводили по методу ФишераСтьюдента. Оптимальная концентрация глицерина 5-7,5, 1,2-пропандиола 2-3.П р и м е р 2, Способ осуществляли аналогично примеру 1. Концентрация глицерина в ТК, 1,2-пропандиола - 2,5 ь, Скорость охлаждения до температуры кристаллизации варьировали.Оптимальная скорость охлаждения на 1 этапе - 1-2/мин 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 П р и м е р 3, Способ осуществляли какв примере 1, концентрация криопротекторов глицерина и 1,2-ПД 5 и 2 , соответственно, конечную температуру 1-го этапаварьировали.Оптимальной конечной температурой 1этапа является температура кристаллизации, которая лежит в пределах от -1,0 до-1,5 С, При охлаждении защитного раствора создается начальное переохлаждениевнеклеточного раствора, в результате кристаллизации происходит разогрев всей суспенэии до этой температуры, иевыдерживается оптимальная скорость охлаждения, как следствие, ухудшение сохранности гомостатической функции, атакже уменьшение их количеств, снижениепоказателей ретракции, реакции на гипотонический шок,П р и м е р 4. Способ осуществлялианалогично примеру 1. Концентрация глицерина в ТК 5, 1,2-ПД,57 ь. Варьировалискорость охлаждения от температуры кристаллизации до -6 С.Из представленных данных следует, чтооптимальные скорости охлаждения на 2 этапе 0,4-0.6/мин,П р и м е р 5. Способ осуществлялианалогично примеру 1. Концентрация глицерина 5, 1,2-ПЛ,5. Варьировали конечную температуру 2 этапа охлаждения.Оптимальная конечная температура 2этапа (-6) -(-7) С.П р и м е р 6, Способ осуществлялианалогично примеру 1. Концентрация глицерина 5, 1,2-ПД,5, Варьировали скорость этапа, конечная температура которогобыла -196 С.П р и м е р 7. Способ осуществлялианалогично примеру 1. Концентрация глицерина 5, 1,2-ПД,5. Варьировали конечную температуру в 3 этапа,Оптимальная ко ечная температура 3этапа (-80) - (-196)С.П р и м е р 8, Способ осуществлялианалогично примеру 1 и по прототипу, Данные сохранности тромбоцитов в зависимости от способа консервирования говорят отом, что в случае консервирования предлагаемым способом показатели реакции на гипотонический шок, ретракции и агрегациидостоверно выше, чем в прототипе.Формула изобретенияСпособ консервирования тромбоцитовпутем замораживания их до -196 С в защитной среде, содержащей криопротектор глицерин,отличающийся тем,что,сцельюповышения сохранности функциональнойполноценности клеток за счет повышенияустойчивости их к гипотоничесому шоку,1822782 СоставительТехред М.Моргентал Корректор С.Лисина Редактор Заказ 2169 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101 глицерин берут в концентрации 5-7 или используюткриопроектор 1,2-пропэндиол в концентрации 2-3, а замораживание осуществляют сначала со скоростью 1-2 град/мин до температуры кристаллизациизащитной среды, далее со скоростью 0,4-0,6град/мин до -6-7 С и затем со скоростью5-10 град/мин до -80-196 С,