Способ хранения иммобилизованных микромицетов

СООЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК Щ., 1 77 ГОСУЛАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР Е ИЗСЬРЕТЕЬИВИДЕТЕЛЬСТВУ К АВТОРСКО л. %42кробиологии и вирусо А,А. Белходж ев, М,В.Фат е коллекцио д минеральн 1972, 11 М 5 авваева и Т,Н,Нинных дрожжеым маслом -.А 23 1 2/ Изобретение от робиологии и биот способу хранения ку промышленной биот учению ферментов,кислот и других б веществ. Существуют спо го материала на тя к области микгии, а именно к используемь 1 х в огии с целью полиотиков, аминочески активных оситс хнол льтур ехнол антиб ологи собы хранения споровердых средах под масво ло результаты достигнуты при билизованного на носителе 9 ег, применяемого при осного сока. Способ заключамицелий замораживают для ия при температуре от -25, ом виде его хранят больше осле оттаивания и двухразомицелий используют для обчного сока. Исходная, до(21) 4816801/13 (22) 23.04.90 (46) 15.11.92 Бю (71) Институт м АН КазССР (72) Р.К.Блиева (56) В.И.Кудряв китина. Хранен вых культур и МикробиологияПатент ГДР М 246025 А 1, к Наилучшие хранении иммо мицелия Азр. и ветлении ябло ется в том, что консервирован до -30 С, в так одного года. П вой промывки работки ябло(54) СПОСОБ ХРАНЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ МИКРОМИЦЕТОВ(57) Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Сущность изобретения заключается в том, что для увеличения срока хранения активных продуктов пектолитических ферментов - грибов рода Аврег 9 Шцз и увеличения их ферментативной активности, грибы иммобилизуют на неаппретирован ной хлопчатобумажной ткани - бельтинге и в последующем хранят в условиях голодания культуры при 4 С. Пектолитическая активность культуры Азрег 9 Шоз ааавог 16 через 15 мес хранения достигает 10,25 кд/мл. 2 табл,замораживания, пектолитическая активность сохраняется после хранения.Недостатками прототипа являются усло- - ъ вия хранения иммобилизованного мицелия, требующие морозильные камеры, кроме того ь, способ хранения не обеспечивает хранения у не обеспечивает повышения образованиякультурой пектинрасщепляющих ферментов.Целью изобретения является удлинение сроков хранения культуры в жизнеспособ- С ном состоянии и увеличение их феоментативной активности.Указанная цель достигается путем хра- д нения иммобилизованной мицелиальной культуры Азр, аиаглог 16 неаппретированной хлопчатобумажной ткани - бельтинге при 4 С в условиях голодания, с периодической рекультивацией 1 раз в течение 1,5-3 месяцев на полной питательной среде, содержащей 5 г/л индуктора-пектина.Особенностью заявляемого способа является то, что в результате хранения удается не только стабилизировать, но и повысить в 18 раз активность 8-дневного мицелия, заклэдываемого на хранение.Для осуществления данного способа используют устройство для культивирования. Устройство состоит из качалочной колбы на 750 мл, подложки в форме диска. Для подложки используют пенополиуретан или хлопчатобумажную неаппретированную ткань бельтинг, Для выявления наиболее оптимальных условий хранения споры иммобилизуют на различных носителях и культивируют при разных концентрациях пектина, Контроль за уровнем образования ферментов, продуцируемых мицелием, проводили, определяя активность полигалактуроназы (ПГ), вискозиметрически по методу Витакера в модификации Родионовой с соавторами.П р и м е р 1, 2 О/ водную суспензию спор Азр, аюащог 16 адсорбируют на подложке из пенополиуретана и культивируют 8 дней в колбе на среде со следующим составом, г/л: лактоза 20, пектин 5,(МН 4)2 304 7, КС 0,5, КН 2 РО 4 1, МдЯО 4 0,5, ЕеЯО 4 следы.Анализ активности ПГ и смену культу- ральной жидкости (к, ж,) производят на 3, 6, 8 сутки. После слива к, ж. у 8 - дневной культуры колбу с мицелием ставят на хранение в холодильник при 4 С, Периодически, 1 раз в 1,5 - 3 месяца - культивируют в новой питательной среде, После 8 суток культивирования активность ПГ начала падать (табл, 1) - 0,9 ед, При хранении в последующие 8 суток в холодильнике активность возросла до 2,85 ед, При дальнейшем хранении, на 74 сутки активность продуцируемого фермента достигла максимума, с последующим падением к 121 суткам. После 140 суток в культуре отмечали преобладаниепроцессовлизиса. Срокхранения в этом варианте опыта был 140 суток,П р и м е р 2, 2-ную водную суспензию спор Азр. ааэаог 16 адсорбируют на подложке иэ бельтинга и культивируют в колбе со следующей средой, г/л; лактоза 20, пектин 5, (ИН 4)2 304 7, КО 0,5, КН 2 РО 4 1, М 9304 0,5, -е 304 следы.Иммобилизованный мицелий культивируют и хранят как указано в примере 1. Активность ПГ в к. ж. до хранения также как и в первом варианте опыта уменьшается на 8 сутки, После выдерживания 8 суток в холодильнике активность возрастает в 4 раза по сравнению с исходным и на 74 сутки в 15 раз, Затем наблюдается стабилизация в образовании ПГ до 4 - го месяца, При очередной рекультивации культуры на 160 сутки наблюдали повышение активности в 18 раэ.20 25 П р и м е р 4. 2 О-ную водную суспен 30 40 45 50 10 15 В период от 160 до 360 суток хранения на блюдается стабилизация активности. В последующие 360 - 450 суток активность упала, но относительно исходной была в 9 раз выше, В данном варианте опыта в процессе длительного хранения при рекультивации в новой среде нарастал новый мицелий, который успешно сохранялся в первоначальном виде от одной рекультивации до другой. П р и м е р 3. 2 оь-ную водную суспензию спор Азр. аваеог 16 эдсорбируют на подложке из пенополиуретана и культивируют в среде со следующим составом, г/л: лактоза 20, пектин 20, (К Н 4)2 ЯОа 7, КС 0,5, КН 2 РО 4 1, М 9304 0,5, Ре 504 следы.Иммобилизованный мицелий культивируют и хранят как указано в примере 1. Концентрация пектина - 20 г/л оказывает заметное ингибирующее действие на активность ПГ (табл. 1) и жизнеспособность в динамике, в течение 1 года хранения. Несмотря на появление новых клеток, после рекультивирования степень лизиса значительна,эию спор Азр. аиавог 16 адсорбируют из бельтинга и культивируют в колбе со средой следующего состава, г/л: лактоза 20, пектин 20, (ЙН 4)2 ЯО 4 7, КС 0,5, КН 2 Р 04 1,М 9304 0,5, Ре 504 следыИммобилизованный мицелий культивируют и хранят как указано в примере 1, Несмотря на иммобилизацию мицелия на бельтинге, концентрация пектина - 20 г/л,также как и в 3 варианте опыта оказывает заметное ингибирующее воздействие на индуцирование фермента, Активность ПГ после 8 дней хранения вначале возрастает в 2 раза, затем стабилизируется. К концу года уменьшается относительно исходной в 5 раз, Процессы лизиса в мицелии начинают преобладать с 2 месяцев храненияП р и м е р 5. Из культуры, хранившейся 121 день в оптимальных условиях, т. е. при иммобилизации на бельтинге и концентрации пектина - 5 г/л, получили споровый материал на среде Роллена,При последующем культивировании спорового материала получили результаты,представленные в табл. 2.Как видно из результатов, активность ПГ 3 - дневного мицелия, полученного из культуры, хранившейся 121 день, выше чем активность контрольного обычного, неиммобилизованного 3-суточного мицелия, не. подвергавшегося хранению. Результаты опыта еще раз подтверждают закономерность повышения активности ПГ в оптимальных условиях хранения.1775470 Таким образом, для хранения иммобилизован ного мицелия Аэр. ааатог 16 в течение длительного времени (1 год и 3 месяца) наиболее оптимальными условиями являются следующие: носитель для иммобилизации мицелия - бельтинг, концентрация пектина - 5 г/л. Использование оптимальных условий позволяет не только успешно хранить культуру в виде иммобилиэованного мицелия, но и повысить в 18 раз активность ПГ по сравнению с исходным 8 - дневным мицелием, сохранить ее стабильность на высоком уровне в течение года. Формула изобретения Способ хранения иммобилизованныхмикромицетов, включающий иммобилиэа цию культур грибов рода Аэ регул из - активных продуцентов пектолитических ферментов на носителе и последующее хранение при низкой температуре, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью увеличения срока 10 хранения культур и ферментативной активности, в качестве носителя используют бельтинг, а хранение осуществляют при 4 С в условиях голодания культур. Таблица 1. Влияние различных носителей и концентрации пектина на активйость полигалактуроназы в процессе хранения Активность ПГ, е /мл Срок хранения,суткиКон ент а ия пектина, г/л и тип мате иала пектинг/л бельтинг0,95 1,12 2,82 1,52 8 суток, исходная к льт а За кла ка на х анени 2,85 8,92 46,3,17 2,11 2,15 1,47 0,87 0,33 Табл ица 2 Влияние оптимальных условий на сохранение активности полигалактуроназыПримечание. Контроль - споровый материал, хранившийсяв обычных условиях на среде Роллена под маслом Составитель В.СоинаТехред М.Моргентал Редактор В,Трубченко Корректор П. Гереши Заказ 4022 Тираж . Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, )К, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 16 74 121 160 280 360 450 5,25 15,86.14,42 18,99 18,91 17,51 10,25 1,12 1,21 1,25 1,86 2,05 0,73 0,65