Способ определения адреналина

(57) Изобретеническим методамжет быть испол ышение чувстледующим об.а с ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Латвийский государственный университет им. П.Стучки(56) Авторское свидетельство СССРпо заявке М 4460126/30-14,кл, 6 01 й 33/74, 14,07.88. ОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ А е относится к физико-химианалиэа моноаминов и мозовано для клинического и Изобретение относится к физико-химическим методам анализа моноаминов и может быть использовано для клинического итоксикологического анализов в медицине ифармакологии.Кель изобретения - поввительности способа,Способ осуществляется сразом,К исследуемой пробе, содержащей адреналин, добавляют соляную кислоту до конечной концентрации 0,1-0,2 М, затемнитрит натрия до конечной концентрацйй0,1-0,2 М. Чсрез 20 мин реакционную смесьпродувают воздухом в течение не менее 20мин.Полученную пробу, содержащую нитрозбмин адреналина, добавляют к биоспецифичекому ка)алиэатору с моноаминоксидазной токсилогического анализов в медицине и фармакологии. Цель изобретения - повыше. ние чувствительности способа, Способ включает в себя следующие операции: к анализируемой пробе добавляют нитрит натрия и соляную кислоту концентрации 0,1- 0,2 М, продувают воздухом не менее 20 мин, далее вносят серотонин и инкубируют в присутствии биокаталиэатора с моноаминоксидэзной активностьюдо полного дезаминирования серотонийа с последующим потенциометрическим определением выделившегося аммиака, Предел обнаружения адреналина 1 10 моль/л, что в 2 раза ниже, чем по известному способу.(МАО) активностью и термостатируют, про аьвьпуская через ячейку кислород, затем в реакционную смесь добавляют серотонин (5 10 М) и измеряют время падейиярН на 20 мВ О в присутствии и в отсутствии серотонина. По О градуировочной зависимости с использова- ОО нием метода стандартных добавочных проб 3 определяют содержание адреналина в по- (Л следуемой пробе, исходя из формулЧ/Чх=К( х) (1) Ч/Чп= К( х+а); (2)Ч/Ча=фх+2 а 1, (3) где Ч - скорость ферментативной реакции в отсутствии серотонина (холостой опыт);Ч - скорость ферментативной реакции в присутствии серотонина (ингибитора):Чп, Ч 12 - скорости ферментативных реакций в присутствии различных количеств добавленного серотонина.К - константа;х - концентрацил адреналина е исследуемом растворе;а - стандартная концентрация адренаглина в добавленной пробе,П р и м е р 1. Для построенил градуировочной зависимости 8.24 мг адреналинарастворяют в 4,5 мл 0,1 н, Н С 1, затем добавляют 31 мг 1 чаМ 02, Через 20 мин реакционную смесь продува 1 от воздухом в течение 20 10мин. Голучают 4,5 мл 0,01 моль/л нитроэоамина адреналина, который используют вдальнейших определениях в концентрациях4,5 107 маль/л - 7,2 10"моль/л.0,5 г биоспецифического катализатора с 15МАО-активностью помещают между мембранами ячейки (1) и промываат 0,01 моль/лраствором боратного буфера (рН 7,6) и бидистиллированной водой. Ячейку помещают в сосуд для измерений с газовым 20зазором, добавляют 1,8 мл 0,1 маль/л боратного буфера рН 9,0, 2 мл стандартногораствора нитрозоамина адтреналина концентрацией 4 5 10 . 9 10, 1,8 10, 3,6 хх 10, 7,2 10 моль/л, или 1,8 мл Н 20. 254Измерительный сосуд закрывают, помещают в термастат при 25 ОС, включаютмагнитную мешалку и пропускают 02 безСО 2 до установления постояннога значенияпотенциала на потенциометре (около 10 30мин). Далее поток 02 перекрывают, в реакционную смесь добавляют 0,2 мл сератонина в концентрации 1 10 моль/л (в смеси5 105 моль/л), герметически закрывают сосуд и измеряют время падения рН от 7,05 до 357,38 (на 20 мВ) в присутствии ингибитаранитрозаамина адреналина и в его отсутствии, Рассчитывают отношение Ч/М 1 и строят градуировочную зависимость,40П р и м е р 2. К 1,5 мл 1 10 моль/л-5раствора адреналина добавляют 4,5 мл0.137 М соляной кислоты (концентрации впробе 0,1 моль/л), затем добавляют 42 мгнитрита натрия (концентрация в пробе 0,1 45моль/л), Через 20 мин реакционную смесьпродувают воздухом в течение 20 мин. Получают 6 мл 2,5 10 6 моль/л нитрозоаминаадреналина. который делят на 2 порции, иопределение активности УАО проводят 50аналогично примеру 1, только в реакцион-.ную смесь вводят 0,2 мл серотина в концентрации 1 10 моль/л (в смеси 5,10 моль/л).По градуировочному графику находятконцентрацию адреналина в пробе, т.е. 551,25 10 моль/л, но при определении активности МАО происходило разбавление. начальной пробы в 8 раз, следовательно,5исходная концентрация 1 10 моль/л,П р и м е р Э, К 1,5 М 1 10 моль/л раствора адреналина добавляют 4,5 мл 0, У НС (концентрация в пробе О,"5 моль/л), затем дабавлл 1 ат 62 мг йай 02 (концентрацил в пробе 0,15 моль/л). Через 20 мин реакционную смесь продувают воздухом в течение 20 мин. Получают б мл 2,5 10 маль/л нитразоамина адреналина, который делят по 2 мл на порции и далее определение ведут аналогично пэоимеру 1), только используют 0,1 мл 1 10 моль/л раствора-5 сератанина (в пробе канцентрацил 1 10 моль/л).По градуировочному графику находят концентраци 1 о адреналина в пробе, т.е, 1,25 10 моль/л, но при определении активности УАО происходило разбавление начальной пробы в 2 раза, следовательног исходная концентрация составляет 2,5 10моль/л.П р и м е р 4. К 1,5 мл 1 ф 10 моль/л раствора адреналина добавляют 4,5 мл 0,275 У НС 1 (концентрация в пробе 0,2 моль/л), затем добавляют 84 мг ИаМО 2(концентрация в пробе 0,2 моль/л). Через 20 мин реакционную смесь продувают воздухом о течение 30 мин, Получаот 6 мл 2,5 10моль/л нитрозоамина адреналина, который деллт по 2 мл на порции и определение активности МАО проводят аналогично примеру 1.По градуиравочному графику находит концентрацию адреналина в пробе, т.е.1,25 10 моль/л, но при определении активности МАО происходило разбавление начальной пробы в 2 раза, следовательно, исходная концентрация 2,5 10 моль/л,П р и м е р 5. Для анализа биологической пробы (плазма крови крысы) ее делят на три части, где к первой части ничего не добавляют, к второй части добавляют адреналина концентрацией 1 10 моль/л (концентра-бция в пробе 5 10 маль/л) и к третьей части добавляот адреналина 2 10моль/л (концентрация в пробе 1 10 моль/л). Далее во все три пробы добавляют 0,5 г 1 чаМ 02 и 0.1 мл 2 У НС и пропускают через раствор воздух в течение 20 мин длл удаления окислов азота. В реакционну 1 о смесь дабавллют 2 мл 0,1 моль/л боратного буфера рН 9,0 и 1,8 мл подготовленной пробы без-7 добавки и с добавкой адреналина 5 10 и 1 10 мольл,далеепроводлтвсеоперации аналогично примеру 1.Концентрацию адреналина рассчитывают по формулам (1)-(3), Обнаружено, что плазме крови крысы концентрация адреналина 5 10 моль/л.1756825 Составитель Н. ГуляеваТехред М.Моргентал Корректор И. Муска Редактор 8. Данко Заказ 3085 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5. Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 П р и м е р 6. Для анализа биологической пробы - крови человека - необходимо анализируемую пробу разделить на три части, где к первой ничего не добавляют, к второй частибдобавляют адреналин в концентрации 5 1 10 моль/л(концентрация впробе 5 10 моль/л) и к третьей части добавляют адреналин в концентрацию 2 10 6 моль/л (концентрация в пробе 1 10 моль/л). Далее определение ведут аналогично примеру 5. "10Концентрацию адренэлина в крови рассчитывают по формулам (1)-(3). Обнаружено, что в крови куонентрация адреналина составляет 2,55 10 моль/л.П р и м е р 7, Аналогично, как в примере 15 5, определяют адреналин в экстракте мышцы крысы, Концентрацию адреналина также рассчитывают по формулам (1)-(3). Обнаружено, что в экстракте мышцы крысы содержится 2 106 моль/л адреналина, 20П р и м е р 8. Для анализа биологической пробы-экстракта мышцы кролика - необходимо анализируемую пробу разделить на три части, где к первой части ничего не добавляют, к второй части добавляют адрена лин в концентрации 1 10 б моль/л (концентрация в пробе 5 10 моль/л) и к третьей части - адреналин в. концентрации 2 106 моль/л(концентрация в пробе 1 106 моль/л). 30 Далее определение ведут аналогично примеру 5, Концентрацию адреналина рассчитывают по формулам (1)-(3). Найдено, что в экстракте мышцы кролика концентрация адреналина составляет 1,65 10,Известным способом концентрацию адреналина в экстракте мышцы кролика определить невозможно.По сравнению с известным использование предлагаемого способа позволяет по-, высить чувствительность определения адреналина в биологических обьектах в 2 раза, Предел обнаружения адреналина в заявляемом способе составляет 1 10 моль/л, по известному способу предел обнаружения равен 2 10 М,Формула изобретения Способ определения адреналина, включающий добавление в йсследуемую пробу серотонина, дезаминирование с использованием биоспецифического катализатора с моноаминоксидазной активностью и потенциометрическую регистрацию аммиака, о тлича ющийсятем,что,сцельюповышения чувствительности способа, перед введением в пробу серотонина в нее добавляют соляную кислоту и нитрит натрия в конечной концентрации 0,1-0,2 м для каждой добавки, затем пробы продувают воздухом в течение не менее 20 мин.