Способ подготовки пробы живых микроорганизмов к определению их концентраций

ОПИ ИЕ пц 646763 Совэ Советских Социалистических Республик(22) ЗаявленЬ 280273 (21) 1904844/28-13с присоединением заявки Мо(51)М, Кл.2 С 12 К 1/00 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытийОпубликовано 150879. Бюллетень Йо 30 Дата опубликования описания 150879(72) Авторы изобретения Н. И. Передереев и В. А. Пухов Всесоюзный научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности(54) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ПРОБЫ ЖИВЫХ МИКРООР 1 АНИЗМОВ К ОПРЕДЕЛЕНИЮ ИХ КОНЦЕНТРАЦИИ Настоящее изобретение относитсямикробиологии и может быть использовано при определении концентрации микроорганизмов в ветеринарии и медицине.5Наиболее близким к изобретениюпо технической сущности являетсяспособ подготовки пробы живых микроорганизмов к определению их концентрации, заключающийся в том,что пробу микроорганизмов инокулируютлактозный бульон, содержащий С -замещеннуюлактозу, и подвергают инкубированию в течение определенного времени при 37 фС 1). 15Бактерии в процессе роста расщепляют радиоактивную лактоэу 1 выделяющийся радиоактивный С 4 О адсорбируется гидроокисью бария с образованием при этом радиоактивногоВаС ОЭ. Уровень радиоактивности выделенной культурой микроорганизмов поотношению ко времени является величиной прямо пропорциональной числумикробных клеток в пробе,Для того чтобы определить количество живых бактерий по такому способу требуются специальйые приспособления, обеспечивающие наиболееполное улавливание высвобождающегося в процессе расщепления лактозы С О, что сопряжено с потерей С О и неизбежным искажением результатов исследований.Культивирование микроорганизмов по этому способу производят при 37 .С, что чревато опасностью роста банальйой .микрофлоры (стрептококки, стафилококки, грибки и др.). При анализе молока и молочных продуктов в пробе могут оказаться и патогенные микроорганизмы (бруцеллы, возбудители паратифа и др.), которые также активно расщепляют лактозу.В связи с этим конечный результат измерения радиоактивности С 4 Ох не может быть отнесен к определенйому виду бактерий; Следовательно, получаемый резулЬтат не позволяет судить о точном количестве клеток в исследуемом образце.С целью упрощения процесса подготовки и повышения точности определения концентрации нативных микроорганизмов инкубирование проводят с радиоактивным изотопом Р 32, взятым в виде двуэамещенного фосфата натрия, при 2-8 С, в течение 18-24 ч, после чего клетки микроорганизмов отделяют от супернаТайта.646763фужные пробирки. Одну из проб инактивируют нагреванием при Т з + 100 Св течение 30 мин. К охлажденнойпробе термоинактивированных клетоки к пробе с нативными клетками добавляют равиоактивный раствор двух 5 замешенного Фосфорнокислого натрия,так чтобы удельная активность Р 2в пробах составляла 4 мккюри/мл.Интактные и термоинактивированныеклетки с радиоактивным изотопом10 оставляют.на экспозицию при 2-8 С.В этих температурных условиях ненаблюдается роста и деления клеток.Инкубирование нативных кЛетокс радиоизотопом проводят в течение 18-24 ч, так как количество Робнаруживаемое при ассимиляции жи"выми клетками, к этому времени достигает максимальных значений. Сорбция изотопа инактивированными клетками достигает максимума уже последвух часовой экспозиции.После инкубации с изотопом клетки обеих проб четырехкратно отмывают центрифугированием в течение20 мин на ЦУМпри ф 000 об/мин споследующим сливом супернатанта иресуспенэированием осадка в 10 млводы.Отмытые клетки разводят до исходной концентрации, добавляя 5 мл30 воды, суспендируют и используютдля анализа. Из каждой пробы берутпо 1 мл суспенэии клеток трехкратно.Образцы помещают на мишени-подложки, высушивают и измеряют активность35 изотопа Рз на радиометрической ус- .тановке типа Бс торцовым счетчикомтипа Т-БФЛ (или на жидкостномсцинтилляционном спектрометре типаАВАС БЬбез высушивания об 40 Разцов) в нативной я, и термоинактивированной М 2 пробах. По значениюМ-К 2 с помощью калибровочной кривой ай (см. фиг." 2) определяют концентрацию живых микроорганизмов. Формула изобретения 3В основе изобретения лежит способность живых клеток активно ассимилировать вещества, необходимыедля их жизнедеятельности, в отличиеот мертвых, накапливающих химические соединения только по законамсорбции и диффузии. Это позволяетпроводить измерение радиактивностинепосредственно в клетках при включении радиоактивного изотопа послеинкубации их с меченым соединением.Указанное обстоятельство упрощаетпроцесс и повышает точность опредеделения. Определение концентрациимикроорганизмов заключается в из-мерении радиактивности нативных итермоинактивированных микроорганизмов, причем инкубирование нативнойпробы с радиоактивным изотопомпроводят при 2-84 С в течение 18-24 ч - " " аинактивированной - при той же температуре не менее 2 ч. В качестверадиоактивного изотопа используютР 2в виде двузамещенного фосфорнокислого натрия. С помощью калибровочной кривой по уровню активностиЪ 1Р , коТорый включается в клеткипри ассимиляции, находят концентрацию живых микроорганизмов.Характерно отметить,что концентрацию живых бактерий в исследуе"мом препарате можно определить втечение суток, что в несколько разбыстрее бактериологического методавысева культуры в чашки с агаром.На фиг, 1 показана зависимостьинтенсивнооти ассимиляции и сорбцииизотопа соотвественно нативными итермоинактивированными клеткамиЬ цсеИа обоицэ (шт. 19) от удельной активности Рпри инкубацни винтервале 0,25-4 мккюри/мл (концентрация бруцелл составляет 200 млрдмикробных тел/мл); на фиг. 2 - зависимость количества радиоактивногоизотопа, связавшегося при ассимиляции живыми и при сорбции мертвымиклетками, от концентрации бруцелл.Как видно из фиг, 1 интенсивностьассимиляции изотопа Р " живыми бруцеллами (1) в несколько раз превышаетсорбцию его мертвыми клетками (2).Скорость счета Р 2 от нативных бруцелл пропорционально возрастает при50увеличении концентрации ( Я ).Активность сорбированного изотопатакже возрастает с увеличениемконцентрации термоинактивированныхклеток ( м 2 ), но на порядок меньше(см. фиг. 2),Обнаруженные закойомерности .позволяют построить калибровочную кривуюзависимости дй й, - М 2 от концентрации живых микроорганизмов, где 60М и К 2 соотвественно активностьР в нативной и термоинактивированной пробе.П р и м е р, Бакмассу с неизвестной концентрацией клеток стерильно разливают по 5 мл в две центриСпособ подготовки пробы живыхмикроорганизмов к определению ихконцентрации в пробе, включающийинкубирование микроорганизмов срадиоактивнйм иэотопом, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с цельюупрощения процесса подготовки и повышения точности определения концентрации нативных микроорганизмов,инкубирование проводят с радиоактивным иэотопом Р . , взятым в видедвуамещенного фасфата натрия, при2-8 С в течение 18-24 ч, после чегоклетки микроорганизмов отделяют отсуспернатанта.Источники информации, принятые вовнимание при экспертизе1. Патент США 9 2.914.447,кл. 195-1035, 1959Подписноета СССРтийб. 4 5. 4827/60ЦНИИПИ Го митепо дел кры3035 Моск наал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Заказ или Составитель И. НасоповскийРе акто Т. Коло ева Тек Э.Чужик Ко екто Е, Лукач