Способ определения инсулиноподобных ростовых факторов i и ii в сыворотке крови человека

(51)5 6 01 17446 535 ГОСУДАРСТВЕННЫЙПО ИЗОБРЕТЕНИЯМПРИ ГКНТ СССР МИТЕТОТКРЫТИЯМ О ЗОБ АН Т И исследовател сывороток и ева. пчез 1., 1972, ч,Я ИНСУЛИНОАКТОРОВ 1 И 11ОВЕКА Изобр именно к деления р использов гии. ев емеК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Центральный научноский институт вакцин иИ.И.Мечникова(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИПОДОБНЫХ РОСТОВЫХ ФВ СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛ етение относится к медицине, а иммунологическим методам опре остовых факторов и может быть ано в клинической эндокриноло Цель изобретения - сокращени р ни определения гормона,Указанная цель достигается тем, что используют планшет, который насыщают антителами к ИРФ 1 и 11 при рН 9,4, затем помещают на него испытуемую сыворотку и после инкубации и отмывки добавляют конъюгат антител к ИРФи 11 с пероксидазой хрена, инкубируют при 37, вновь отмывают, добавляют субстратную смесь, инкубируют в темноте, останавливают реакцию раствором серной кислоты и по интенсивности окрашивания определяют на спектрофотометре количество ИРФ 1 и 1. Предлагаемый способ иммуноферментного определения ИРФ 1 и 1 позволяет безэкст(57) Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологическим методам определения инсулиноподобных ростовых факторов, и может быть использовано в клинической эндокринологии, Цель изобретения - сокращение времени определения. Использован твердофазный иммуноферментный анализ, включающий сорбцию специфических антител на полистироловом планшете, добавление испытуемой сыворотки, инкубацию с конъюгатом специфических антител с пероксидазой, внесение субстратной смеси и определение концентрации инсулиноподобных ростовых факторов по интенсивности окрашивания при длине волны 492 нм,ракционным путем определять микроколичества и сократить время анализа.Способ осуществляют следующим образом.ююВИммуноферментная тест-система для определения ИРФ 1 и 1 основана на методе двойных антител с использованием твердо- фь фазного носителя. Источником антигена (, ИРФ 1 и 11 служитткань опухоли из 3-клеток )ц островков Лангерганса - инсулинома. Для получения антигена из опухоли используют метод Васильевской И,В. Способ выделения и очистки ИРФ 1 и 11 включает получение ацетонового порошка.из ткани опухоли, эк- в стракцию этанолом-НС 1, осаждение спиртацетоновой смесью и гельфильтрацию в кислых условиях с ИаС 1. Получают гомогенный, высокоочищенный препарат, содержащий инсулиноподобные ростовые факторы 1 и 1. Чистоту и гомогенность контролируют электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом по Й-концевым амино 1744651кислотам дансильным методом, а также аминокислотным автоматическим анализатором,Инсулиноподобные ростовые факторыипредставляют собой два низкомолекулярных пептида с М. в, = 7500 Дальтон.Источником антител к ИРФислужит гаммаглобулиновая фракция моноспецифической сыворотки против человеческого препарата ИРФииз инсулиномы, Фракцию получали двукратным осаждением сульфатом аммония до 33 и 50% насыщенияНа весь цикл иммунизации берут на одного кролика 8 мг высокоочищенного гомогенного антигена в 4 мл физиологического раствора и 4 мл полного адьюванта Фрейда, четыре инъекции делают с интервалом в 14 дней, ,иинъекции проводят подкожно в 4 точки в области спины в нарастающих дозах: 0,25, 0,5 и 1,0 мл соответственно в каждую точку, а Ч инъекцию - по 0,5 мл в подкожные лимфоузлы.Для получения антител используют иммунную сыворотку с титром не менее 1:32, 1:64 в двойной радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони. В иммуноферментном определении используют коньюгат антител к ИРФ - с пероксидазой хрена в рабочем разведении 1;400. Субстратной смесью в тест-системе служит раствор 2,4-ортофенилендиамина (основной раствор:10 мг ортофенилендиамина в 1 мл метанола; рабочий раствор: 100 мкл основного раствора в 10 мл 0,05 М цитратного буфера, рН 4,7) с 33% перекисью водорода (2 мкл).Для проведения иммуноферментного анализа в каждую лунку полистиролового планшета вносят по 0,2 мл антител к ИРФив 0,01 М в карбонат-бикарбонатном буфере, рН 9,4, планшеты выдерживают 1 ч при 37 С, а затем 24 ч при 4 С. Далее планшеты обрабатывают 0.5%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина или манитолла в течение суток при 4 С, Планшеты многократно отмывают отмывающим раствором, состоящим из 0,1 М фосфатно-солевого, рН 7,4, буфера, 0,05%-ного Таинаи 0,1%-ного бычьего сывороточного альбумина, высушивают, плотно закрывают и хранят при 4 С.В лунки первого ряда вносят по 0,2 мл отмывающего раствора, а в лункиирядов по 0,2 мл стандартного антигена в двукратных разведениях, в остальные лунки - в дублях исследуемые сыворотки, После инкубации в течение 24 ч при 37 С планшет вновь отмывают и в лунки вносят по 0,2 мл конъюгата в рабочем разведении. Планшеты выдерживают 24 ч при 37 С и после от 10 20 25 30 35 40 45 50 мывки вносят раствор субстрата в объеме 0,2 мл, на 1 ч помещают в темноту, реакцию останавливают 0,05 мл 50%-ным раствором серной кислоты. Продукт реакции желтого цвета, его интенсивность оценивают по оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 492 нм. Количество антигена в исследуемых образцах, пропорциональное количеству связанного конъюгата, определяют по количеству гидролизованного субстрата. Содержание ИРФив образцах определяют по калибровочной кривой, полученной при исследовании двукратных разведений стандартного антигена,Таким образом, предлагаемый способ иммуноферментного определения ИРФив цельной сыворотке в течение 2 сут без предварительной трудоемкой обработки образца, позволяет использовать для его массовых обследований больных и висследовательских целях.Способ иллюстрируется следующимпримером.Иммуноферментное определение инсулиноподобных ростовых факторов и(ИРФи ) в сыворотке крови больной М. осуществляли следующим образом, Для определения ИРФииспользовали полистироловый планшет, насыщенный антителами к ИРФив концентрации 3 мкг/мл. В лунки первого ряда вносили по 0,2 мл отмывающего раствора, состоящего из 0,1 М фосфатно-солевого буфера, рН 7,4, 0,05%-ного Твинаи 0,1%-ного бычьего сывороточного альбумина. В лунки второго и третьего рядов вносили по 0,2 мл стандартного антигена в двукратных разведениях(в дублях) для построения калибровочного графика. Разведение стандарта начинали с концентрации 100 мкг/мл, В лунки четвертого ряда - 0,2 мл цельной сыворотки больной М,(в дубле), Планшет инкубировали 24 ч при 37 С. После инкубации планшет многократно отмывали отмывающим раствором, Затем во все лунки вносили по 0,2 мл коньюгата антител к ИРФис пероксидазой в разведении 1:400. Планшет выдерживали 24 ч при 37 С и отмывали аналогичным способом, В каждую лунку планшета вносили 0,2 мл субстратной смеси и помещали на 1 ч в темноту, реакцию останавливали 0,05 мл 50%-ным раствором серной кислоты. Продукт реакции был желтого цвета, его интенсивность оценивали по оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 492 нм,Содержание ИРФив сыворотке больной М определяли по калибровочному графику, где по оси абсцисс - концентра1744651. 20 25 30 40 45 50 Составитель И.БашкаевТехред М.Моргентал Корректор З,Садко Редактор Ю,Середа Заказ 2196 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 ция стандартного антигена, по оси ординат - оптическая плотность образцов (для удобства можно использовать полулогарифмические координатные оси, так как концентрация стандарта используется в до статочно широком диапазоне).Величина ИРФив сыворотке больной М, составила 34,8 мгк/мл. Больная М. наблюдается у зндокринолога по поводу акромегалии. 10Таким образом, в течение 2 сут без специальной обработки в цельной сыворотке больной М. было определено содержание инсулиноподобных ростовых факторови .Формула изобретения 15 Способ определения инсулиноподоб-. ных ростовых факторовив сыворотке крови человека с помощью специфической антисыворотки к инсулиноподобным ростовым факторам, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью сокращения времени проведения способа, используют иммуноферментный анализ путем нанесения специфических антител на полистироловый планшет при рН 9,4, инкубации в течение 1 ч при 37 С и в течение 18 ч при 4 С, добавления исследуемой сыворотки и выдерживания смеси в течение суток при 37 С, внесения антител к инсулиноподобным ростовым факторам, меченых пероксидазой хрена, и после контакта в течение 24 ч при 37 С и добавления на 1 ч. раствора субстрата, пробу фотометрируют при длине волны 492 нм,