Способ получения коллагеновых микроносителей

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОЛ ВЫХ МИКРОНОСИТЕЛЕЙ (57) Использование: биотехнолог вирование клеток. Сущность изо зольный спилок шкур: крупного скота подвергают щелочно-соле ботке в. течение 120-144 ч, абра каллагенсодержащую массу прап рез щелевой гомогенизатор при вращения винта 80.-140 мин 1, э аютв осадитель череэ фильерй ром 0,5-1,5 мм при скЬрости винта мешалки 1200-4000 мин осуществляют модификацию к 0,85-0,90 О -ным спиртовым раств (нитрофурил)-акролеина, 1 табл. 21) 4802935(13(71) Ленинградский институт текстильной илегкой промышленности им. С, М, Кироваи Научно-производственный центр медицинской биотехнологии(56) Заявка ЕПВ М 0101285, кл. С 12 М 5(ОО,1984.Авторское свидетельство СССРМ. 1396602, кл, С 12 К 5(00, 1986,ЛАГЕН подщелачивают до рН 11 и оставляют на ночь. После этого рН снижают.до 7,0-7,5 при.этом коллаген преципитируется) и осадок промывают водой. Затем преципитат вновь растворяют в разведенной соляной кислоте при рН 3, вновь преципитируют подщелачиванием раствора до рН 7-7,5 и отделяют центрифугированием.Химическое модифицирование полученного коллагена проводят путем обработки его янтарным ангидридом, При этом свободные аминогруппы коллагена превращаются в свободные карбоксильные группы и коллаген приобретает отрицательный заряд, Степень замещения аминогрупп на . карбоксильные составляет 80-90, Возможно дальнейшее модифицирование коллагена обработки его метиловым спиртом в присутствии кислого катализатора, При этом метиловые группы спирта взаимодейИзобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения коллагеновых микроносителей, используемых в качестве субстрата для культивирования клеток.Известен способ получения коллагеновых микроносителей; заключающийся в том, что кожу теленка раэмалывают, размол помещают последовательно в 5-ный раствор ЙаС 1, 1 ф-ный раствор бикарбоната натоия (для удаления растворимых компонентов) и воду, Далее в воду с размолом вводят пепсин в количестве 0,5 О, от массы размола, затем добавляют соляную кислоту до рН 3. Нерастворимый коллаген в этих условиях растворяется при.20-25 С и перемешивании, По окончании процесса растворения раствор коллагена фильтруют через фильтровальную бумагу, миллипоровские фильтры 1 мкм и 0,45 мкм. Фильтрат аеваЪ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР ия, культибретения;рогатого вой образующуюся ускают ческорости атем под-,с диаметвращения , а далее оллагена ором Р -5 1738851ствуют с карбоксильными группами колла- гена, в результате чего отрицательные заряды, создаваемые карбоксильными группами, гасятся и коллаген приобретает положительный заряд. Степень метилирования составляет 60 - 800.Полученный описанными способами химически модифицированный коллаген растворяют в разбавленной .соляной кислоте (рН 3) и получают 0,3 ф-ный раствор колла- гена. Эти растворы фильтруют череэмиллипоровский фильтр 0,45 мкм и разливают по чашкам Петри. После высушивания асептически на воздухе чашки облучают в течение 1 ч ультрафиолетом для сшивки коллагена. Затем коллаген-покрытие чашки трижды промывают раствором Хэнкса.Культивирование клеток на полученных коллагеновых микроносителях осуществляют в присутствии эмбриональной коровьей сыворотки или фибронектина, Придание заряда поверхности коллагена улучшает прикрепляемость клеток к субстрату и эффективность их роста. Кроме того, при, культивировании в этом случае клетки снимаются с поверхности с высокой степенью эффективности и без повреждения.Однако описанный способ получения коллагеновых микроносителей отличается большой сложностью технологического процесса, которая состоит в необходимости многократной (4-кратной) фильтрации раствора коллагена через фильтры с малым диаметром пор.Известен способ получения коллагеновых микроносителей для культивирования клеток путем щелочно-солевой обработки эольного спилка шкур крупного рогатого скота в течение 96 - 100 ч с последующим выделением коллагена в среду ацетона и модифицированием его 0,6-0,8 ф-ным спиртовым раствором ф-(нитрофурил) акролеина в течение 6-15 ч;Однако культивирование клеток на пол-. ученныхых этим способом микро носителях, позволяет достичь величины индекса пролифирации лишь на 4-е сутки 2,3 - 3,0. Кроме того, получают коллаген в виде пленок, которые обладают недостаточным рабочим обьемом, и для более удобного способа использования их необходимо измельчать до требуемых размеров, что я вляется технологически трудновоспроизводимым.Целью изобретения. является повышение качества коллагеновых микроносителей при сокращении длительности процесса,Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения коллагенновых микроносителей, заключающемуся в том. что зольный спилок шкур крупного рогатогоскота подвергают щелочно-солевой обработке в течение 120-144 ч, обрзующуюся. коллагенсодержащую массу пропускают че 5 рез щелевой гомогенизатор при скоростивращения винта 80-140 обмин, затем подают массу через фильеры с диаметром отверстий 0,5-1,5 мм при скорости вращениямешалки 1200-400 об/мин на осаждение в10 среде ацетона, а модификацию выделенного коллагена ведут 0,85 - 0,90-ным спиртовым раствором . р -5-(нитрофурил)акролеина в течение 4 - 6 ч.15 Полученные предлагаемым способомколлагеновые микроносители при использовании в процессе культивирования позволяют повысить индекс пролифирации с 2,3-3,0(известный способ) до 7-8,7.20П р и м е р 1, Зольный спилок шкуркрупного рогатого скота подвергают фосфатной обработке 0;60(-ным раствором дву-,эамещенного фосфата натрия при рН 8,9 в25 течение 12 ч. Затем в течение 120 чподвергают щелочно-солевой обработке (150 гйаОН на 1 л 1 н, раствора безводного сульФата натрия), а затем 1 н. раствором сульфата натрия. После:этого30 коллагенсодержащую массу промываютпроточной водой для удаления ионов3 03 и нейтрализуют 0,02 н; раствором,соляной киелоты. Далее коллагеновую массу ссодержанием 1,5% коллагена винтовымпрессом при скорости вращения винта.80об/мин под давлением 0,3 МПа подают через щелевой гомогенизатор на фильерныйкомплект осадителя, над которым на рассто янии 1 мм вращается лопастная мешалка соскоростью 1200 об/мин. Коллагеновая масса, проходя через отверстия диаметром 0,5мм, осаждается в ацетон, разбиваясь намелкие частицы эа счет вращения мешалки.:Обводненную массу с содержанием колла 5 гена 30 подают на повторное осаждениесвежей порцией. ацетона, затем на центрифугу, где содержание белка увеличиваетсядо 75. После центрифугирования проводят сушку коллагена и расфракционирова 50 ние, Затем полученные частицынеопределенной формы модифицируют0,85 -ным спиртовым раствором ф-(нитрофурил) акролеина.Режимы получения и свойства микроносителей по примерам 1-8 даны в таблице.Таким образом, в сравнении с известным предлагаемый способ позволяет достичь повышения качества коллагеновыхмикроносителей при сокращении длительности процесса,1738851 Режим обработки Качество елевото и таПример Размер мик рочастиц,мкм Увеличение численности клетокэ рН сам Концем.трацняраство.ра4 аОН,Скоро.сть вра.щения винта. мин Температурал,ьС.аН-Р 4 Чеа Диаметрфильеры, мм Концем.трацняраствараНФ 4,Коицен. трация раствора 1 чаН Рак. СНО Скорость вра щения мешалки. мнн.1 Продел. житель ность"обре.боти. ч 8,85 80 15,0 120 8,9 1200 6,1 8,0 6.1 8,9 0,90 82 85 0,5 1400 12 144 15,0 4.8 5.2 О,б 8,0 1212 14415,0 80 8.9 1800 1,0 085 6,2 100 6.7 8,3 8,7 9,0 8.3 8,6 8,9 1 О 4000 15,0 0.6 6.6 144 0,95 12 15,0 120 2500 6,3 085 130 12 6 0.6 7О.Ь 15.0 8,9 6,2 0.90 0,5 5,2 6,8 6 Л 2 8.9 15 1720 090 144 15,0 6,0 12 5,8 5.8 0.6 120 15.0 8.4 7.2 0,90 П р и ма на н не. Контроле культивирования осуществляют цв ми кроноснтелях, полученных по известному способу и на био микроносителеИитодекс - 3. Составитель 3; Пухова зедактор В. Петраа Техред М,Моргентал Корректор А, Осауленко. Заказ 1978 . Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035; Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101 Формула изобретенияСпособ получения коллагеновых микро- носителей; включающий щелочно-солевую 5 обработку зольного спилка шкур крупного рогатого скота, осаждение образующейся коллагенсодержащей массы в среде ацетона с последующей модификацией коллаге-. на, о т л и ч а ю щи й с я тем, что, с целью 10 повышения качества целевого продукта при сокращении длительности процесса, щелочно-солевую обработку проводят в течение 120 - 144 ч, образующуюся коллагенсодержащую массу перед осаждением в.среде ацетона пропускают через щелевой гомогениэатор при скорости вращения винта 80-.140 мин, затем подают в осадитель через фильеры с диаметром 0,5-.1,5 мм при скорости вращения мешалки 1200-400 мин, а модификацию коллагена ведут 0,85-0,90- ным спиртовым раствором ф-(нитрофурил) акролеина,140+40 180+ 80 180+ 20 150 ч 5 б ПО +40.150 О 180+ 80 140+ 40 180 ч 40 140 +20 170 эх 150+ 40 180 +80 150 ч ЭО 180+ 80 140+20 .