Способ получения диагностикума для выявления антител к вич

(19) К 17/00, 0 01 5) 5 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ЕТЕЛЪСТ К АВТОРСКОМУ(53) 576.8.093(088.8) т ядерной фи Носкин, Ф.С.Носзоренова р.375 г 382;ментная дляиммунодефиамент произа директоромологии и мик- .Т.В.Перадзе(56) Апа 1.Восмаев.Тест-система определения анти цита человека "Эп водства М 138 - 88 Ленинградского Н робиологии им.15,11.88. 1980, 105, иммунофе ел к вирусу итоп". Рег Утвержден ИИ эпидем Пастера смесь 3 различных синтети (соответствующих антигенн . там мембранных белков В Н 1 Ч 1 МЧЕ 1 1, 41 НО 2 ЯОО в лунки полистирольных пл руютвтечение 36 чпри 37 С боратным буфером планше при 370 С в течение 6 ч. ческих пептидов ым детерминан- ИЧи ВИЧ И;Н 1 Ч 1 23 вносят аншет и инкуби, После отмывки ты подсушивают оба недостаточза антител с помальный. титр евышает 1:100, ление сыворотще наблюдается ая десорбцией неравномерная рольной матриИзобретение относится к биотехнологии иммуносорбентов, используемых для диагностики инфекционных и аутоиммунных заболеваний.Известен способ иммобилизации пептидов на планшетах для микротитрования, Способ заключается в том, что на поверхности пластика адсорбируют белки, Время сорбции составляет 12-24 ч, Количество белка составляет 100 - 200 нг на лунку,Недостатком данного способа иммобилизации пептидов, основанного на физической сорбции, является десорбция пептидов на последующих стадиях анализа, что снижает чувствительность метода анализа.Наиболее близким к предлагаемому является способ получения тест-системы "Зпитон". Способ заключается в том, что(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИЧ (57) Изобретение относится к биотехнологии иммуносорбентов, используемых для диагностики инфекционных аутоиммунных заболеваний. Цель изобретения - повышение чувствительности и специфичности определения. Для этого полистирол активируют 0,1-0,01 -ным водным раствором глутарового альдегида в течение 20 - 30 мин при 37 С, затем к активирован ному полистиролу присо- . единяют альдоенолдекстран в концентрации 1 - 4 мкг/мл при рН 7,5 - 8,5 и 37 С в течение 3 ч и осуществляют ковалентное связывание пептидов в концентрации 1 - 4 мкг/мл с альдоенолдекстраном при рН 7,5 - 8,5, 40 - 600 С в течение 20-24 ч, 2 табл. Однако у данного спос ная чувствительность анали мощью планшет (макси сыворотки больного не пр 1;200 - максимальное разде ки больного, при котором е цветная. реакция), вызванн пептидов во время анализа; сорбция пептидов полистирН 7,5-8,5. Реакцию ковалентного присоединения пептидов с альдоенолдекстраном, 55 связаны с активированным полистиролом, проводят при 40-60 С в течение 20-24 ч, Отмывают боратным буфером с добавлением твина, Отсасывают жидкость насосом иподсушивают планшеты 1,5 - 2 ч при 37 ОС,цей планшет, что снижает воспроизводимость результатов анализа антител.Цель изобретения - повышение чувствительности и специфичности определения.Для этого полистирол активируют 0,1- 0,0105-ным водным раствором глутарового альдегида в течение 20-30 мин при 37 С. К активированному полистиролу присоединяют альдоенолдекстран в концетрации 1-4 мкг/мл при рН 7,5 - 8,5, 37 С в течение 3 ч и затем осуществляют ковалентное связывание пептидов в концентрации 1-4 мкг/мл с альдоенолдекстраном при рН 7,5 - 8,5, 40-60 С в течение 20 - 24 ч.Ковалентное присоединение пептидов к планшетам прочными химическими связями увеличивает сорбционную емкость планшет. Десорбции пептидов при последующих анализах не наблюдается, что повышает чувствительность анализа антител, Альдоенолдекстран образует "ножку" между материалом планшет и пептидами, что делает пептиды стерически более доступными для взаимодействия антиген - антитело. Это также приводит к увеличению чувствительности выявления антител. Применение альдоенолдекстрана способствует образованию монослоя пептидов на планшете,Иммобилизация пептидов на полистирольных планшетах. В работе использованы синтетические пептиды, синтезированные в Институте биоорганической химии им. Шемякина (Н 1 Ч 1 АЧЕ 1, 41 НЧ 2 ВОО,41 Н 1 Ч 1 2 з), соответствующие антигенным детерминантам поверхностных белков ВИЧи ВИЧ 1,Используют планшеты для иммуноферментного анализа однократного применен ия (ТУ 64-2-375-86, производство Ленинградского завода медицинских полимеров),Планшеты активируют 0,1-0,01 ОД-ным водным раствором глутарового альдегида при 37 С в течение 30 мин. После отмывки от избытка альдегида боратным буфером рН 7,5-8,5 в лунки планшет вносят альдоенолдекстран с концентрацией 1 - 4 мкг в 1 мл боратного буфера. Выдерживают 3 ч при37 С. Затем отсасывают жидкость из лунокпланшет насосом и добавляют либо в смеси(1:1:1), либо в отдельности пептиды в концентрации 1 - 4 мкг на 1 мл боратного буфера 5 10 15 2025 3035404550 Реакция выявления антител ВИЧ.Постановку реакции осуществляют с сывороткой из свежей негемолизированной крови. Перед постановкой иммуноферментногоанализа планшеты однократно промывают бо-.ратным буфером, Иммуноферментный анализна планшетах, полученных по предлагаемомуспособу, проводят согласно инструкции поприменению иммуноферментной системы дляопределения антител к вирусам иммунодефицита человека. Измерение оптической плотности производят спектрофотометрическипри длине волны 492 нм непосредственно впланшетах на приборе МРМсгорадеВеас 1 ег,В табл,1 приведены данные по ковалентному связыванию пептидов по отдельности и в смеси с полистиролом предлагаемымспособом, Концентрация пептида и альдоенолдекстрана 4 мкг/мл. Реакцию связывания пептидов с полистиролом проводят прирН 8, 16 при 60 С. Как видно из представленных данных пептиды как в смеси, так и вотдельности, нанесенные на планшеты, дают приблизительно одинаковую чувствительность метода анализа, несколько хужеработает планшета с пептидом Н 1 Ч 11 АЧЕ 1 1.Чувствительность определения антителв результате иммобилизации пептидов.В табл,2 представлены данные анализаантител к ВИЧ с помощью планшет, полученных предлагаемым и известным способами,Чувствительность и специфичность определения антител.Как видно из представленных данныхпри использовании планшет, полученныхпредлагаемым способом, чувствительностьанализа антител к ВИЧ возрастает в 10-20раз по сравнению с известным.формула изобретенияСпособ получения диагностикума длявыявления антител к ВИЧ путем связываниясинтетических пептидов, соответствующихантигенным детерминантам белков ВИЧиВИЧ 1, с полистирольной матрицей, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью повышениячувствительности и специфичности определения, полистирольную матрицу предварительно активируют 0,01-0,1%-ным воднымраствором глутарового альдегида при 37 Св течение 20 - 30 мин, активированную матрицу обрабатывают раствором альдоенолдекстрана с концентрацией 1 - 4 мкг/мл прирН 7,5 - 8,5 и 37 С в течение 3 ч, а связываниематрицы с пептидами осуществляют при рН7,5-8,5 и 40-60 ОС путем обработки матрицыраствором пептидов с концентрацией 1-4мкг/мл в течение 20-24 ч.17123 б 2 Таблица 1 Таблица Редактор Н. Касарда ен орректор Н, Ревск а ои акаэ 50 ВНИСоставитель НТехред М,Морге Тираж Подписноеосударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СС 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 венно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 1