Способ определения антител в твердофазном иммуноферментном анализе

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИН 119) (11) 589 01 и ЗЗ/5 З ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 21)22 дофазном Сущность о". о д им мун изобр п ос л-" Фазе в иоо ленни антител в тв фермснтном анализе ения заклю тс том, чттвердой сорбции ант внесения и у добавляют 5-2,0 М моче ом сыворотк)ген следуемых антит содержааботаннуюекопитаюраствор инуи о щнй О,иеисинших и крови Л ВА)А 1 ИВммуноьзоваконцентрации 1-27.ата белок А-перокну в концентрациие точности определ а в раствор идаза вносят 0,2-0,5 М,По- д Ю ения антител 2 табл.конью мочев ышени оатве тодах но поимерами. аналицен ния антит Цель дяосоде твердофвин мочев 2,0 моль/ сыворотк нечной е чий раст ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Научно-исс. вдов ательс киитут эиииемиологии и микробиологим. Пастера(57) Изобретение относится к идиагностике и может быть исполно в ме иммуноферментного Изобретение относится к иммунологци и может быть использовано в методах иммуноферментного анализа (ИФА), в иммунодиагностике заболеваний человека и животных, в сероэпидемиологии, экспериментальной иммунохимии и биотехнологии.Цель изобретения - повышение точности твердофаэного ИФА для определе стигается тем, что антитещий материал контактируют зным антигеном в присутстны в концентрации 0,5- и обработанной пепсином крови млекопитающих в коконцентрации 1 Х, а в рабор конъюгата белок А-перокза и нммучодиагностике заболеваниичеловека и животных, в сероэиидемиолонн, экспериментальной иммунохимии и биотехнологии. Цель изобретения заключается в повышении точности сидаза вносят мочевину в кон трации 0,2-0,5 моль/л,Способ осуществляется следующимобразом,1,1. Твердофазный антиген получа.ют посредством сорбции антигена вполистирольных плоскодонных планшетах для иммунологических реакций(Ленинградский завод "Медполимер"),Раствор антигена в объеме 0,1 мл выдерживают в лунках планшета 18 ч при4 С, после чего его удаляют,о1,2. Для блокады остаточной сорбции в лунках вносят в них по 0,15 мл0,5 Х-ного раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА) в глициновомбуферном растворе (ГБР) следующегосостава, моль/л: глицин 0,1; хлориднатрия 0,15, рН 8,2Этот раствор вы - держивают в лунках 1 ч при 20-24 ОС, затем удаляют.1.3Проводят 4-кратную промывку лунок рабочим буферным раствором (РБР) следующего состава: фосфатный буферный раствор (рН 7,2-7,4) 0,01 моль/л; хлорид натрия 17; БСА 0,057; твин0,052. На каждую про- О мывку расходуют по 0,15 мл РБР.1.4. Затем в лунки планшета вносят исследуемые сыворотки: согласно прототипу - сыворотки предварительно разводят в 100 раз рабочим буфер ным раствором и вносят в лунки в объеме 0,1 мл; согласно предлагаемому способу - первичные неразведенные сыворотки вносят непосредственно в лунки планшета в объеме 0,01 мл и до бавляют 0,09 мл разбавляющего раствора (РР) следующего состава: мочевина 1,0 моль/л; хлорид натрия 0,15 моль/л; твин0,5 г/л; нормальная лошадиная сыворотка,обрабо танная пепенсином 10 мл/л РР.Обработку нормальной лошадиной сыворотки производят предварительно, заготавливая впрок. Для ее получения к нативной сыворотке добавляют крис таллическую лимонную кислоту до рН 4,0-4,5 и 5 мг/мп пепсина очищенного кристаллического, Смесь выдерживают при 18-24 С 1 ч и прогревают при 58 С 45 мин, затем центрифугируют при 4-5 тыс.об. 30 мин, осадок удаляют, а надосадочный слой диализуют против 0,2 И фосфатно-буферного раствора рН 8,2. Полученную диалиэованную ферментированную сыворотку хранят в 40 присутствии мертиолата (при его конечной концентрации 0,01 Ж) в течение гИсследуемые сыворотки выдерживают в лунках планшета ЗО мин при 37 С,зао тем содержимое лунок удаляют и проводят промывку (как указано в п.1.3).1.5. В лунки планшета вносят конъюгат белок А-пероксидаза хрена(производства ЛенНИИЭИ им.Пастера), приготовленный на РБР,содержащем 0,2 моль/л мочевины. Концентрация конъюгата - 100 нг действующего нача-. ла на 1 мл раствора; объем, вносимый в лунку, - 0,1 мл . Раствор конъю гата выдерживают в лунках 15 мин при 18-24 С и повторяют промывки (п.1.3),1.6. В лунки планшета вносят по 0,1 мл хромогенсубстратной смеси,Все остальные операции анализа проводят, как изложено в пп. 1.2-1.8, с теми отличиями, что на стадии контактирования исследуемой сыворотки с твердофаэными антигеном варьируют состав РР - используют ферментированные и неферментированные сыворотки разных видов и в разной концентрации.40 Как видно из табл.2, положительный эффект повышения точности и сни 5 164589Рез,льтаты зависимости ИьА от характера и концентрации сыворотки,вводимой в разбавляющий раствор, представ - лены в табл. (свидетельствчвт о более высокой точности).5Все 54 серопозитивные сыворотки предлагаемого способа по сравнение с прототипом тестируются правильно, все серонегативные не дают ложно- положительных результатов. В прототипе 5 сывороток ошибочно тестируются как отрицательные и 2 - как сомнительные (вариант 9).Положительный эФфект в предлагаемом способе достигается при использовании ферментированной сыворотки лошади и кролика - без существенных различий между вариантами 1 и 2. Иеферментированная (нативная) сыворот ка (вариант 3) не дает эффекта существенного улучшения ИФА: 6 серопозитивных и 3 серонегативных сыворотки определяются как сомнительные ввиду высокого уровня фонового сиг нала. Без добавления сыворотки (вариант 4) возрастает число проб с высоким фоновым сигналом, в результате точного анализа хуже, чем в прототипе. 30Варианты 6-7 демонстрируют зависимость результата ИФА от концентрации ферментированной сыворотки в составе РРНадежный эффект повышения точности ИФА отмечают при концентрации ферментированной сыворотки 17, более высокие ее концентрации существенного эффекта снижения фонового сигнала не дает, поэтому нецелесообразны.Вариант 8 демонстрирует тот факт, что ферментированная сыворотка дает эффект повышения точности ИФА только в сочетании с мочевиной в составе РР. В отсуствие мочевины из-за высо кого уровня фонового сигнала 2 проы из 4 тестируются как отрицательные и 6 проб - как сомнительные.П р и м е р 2. Определяют противодифтерийные антитела в 51 сыворотке, положительной по данным антитоксического теста на кроликах.Условия проведения и зависимость результатов ИФА от вводимых ингредиентов рабочих растворов и их концентрации, приведены в табл.2. 3 6жения Фонового сигнала дает применение в составе РР мочевины в концентрациях 0,5-2,0 моль/л (в сочетании с 17.-ной ферментированной сывороткой лошади или быка). Более высокие кон центрации мочевины снижают специфический сигнал и приводят к появлению сомнительных и отрицательныхрезультатовВарианты 14-18 данного примера доказывают положительный эффект,созданный в предлагаемом способе присутствием мочевинь 1 в рабочем растворе коньюгата, начиная с ее концентрации 0,2 моль/л и до концентрации 0,5 моль/л. Дальнейшее увеличение концентрации мочевины не дает положительного эффекта, а, напротив,снижает абсолютный уровень специфического сигнала.П р и и е р 3. Определяют антитела к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ). В качестве ВИЧ-положительных и ВИЧ-отрицательных сывороток крови беременных женщин использует образцы сывороток из набора П 1 СК МЗ СССР (подтвержденных совпадающими данными ИФА с референс-тестсистемами и данными иммуноблоттинга).Твердофазный антиген готовят из синтетических пептидов в аналог антигенных детерминант ВИЧ из набора тестсистемы нЭпитоп" путем их сорбции в лунках планшета для иммунологических исследований в концентрации 15 мкг пептидов в 1 мл. Далее ИФА выполняют, как указано в пп.1.1 1.3. Получают доказательства повышения точности и специфичности предлагаемого способа, который дает полное выявление всех сероположительных лиц (на 5 человек больше, чем прототип) и лишен ложноположительных результатов при анализе сывороток беременных женщин (прототип и этой группе обследуемых регистрирует 6 случаев "ложноположительных" реакций и 2 случая сомнительных - 64 и 2 Е - соответственно от объема выборки).Таким образом, предлагаемый способ дает воэможность исключить ложиоположительные реакции и дополнительно выявить носителей антител к ВИЧ. Обапреимущества имеют принципиально важ-, ное значение для правильной организации противоэпидемических мероприятий против СПИД.1645898 Таблица Характеристика нов следуемыхсывороток крови доно ров по данным био- пробы"ф " од 19 гкы Всего Рсегополови- сомнительных тельных всего Опыт О, я 92 Характеристикасыворотки в РР отрица- телыаях г Пределы и кол еб аний ри- ант Пределыколебаний составе о о о о 54 0,04-0,07 005-009 006 0,91 0,63-2,00,08 007-0,11 54 СеропозитивиыеСеронегатив- ные 1 ьермеи- тироваиная лоО,О 7 19 наливаяг 2 То ке,кроличьяо о о,ог-о,о 7 О,88 0,58-2,О 0,05 54 СеропозитивныеСеронегативныеСеропозитивныеСеронегативные О,О 1-О, О 8 О,19-О,З 70,16-0,34 о 196 03 165 4 0,04 0,09 006-0,120,86 0,73-2,00,29 0,21-С,371,17 0,88-2,0 19 3 Нативиаялошадиная, 1 Х 48 о,гз 0,26 9 4 Без сы- воротки Серопозитивные Серонегативные Серопозитивиые Серонега- тивные 0,23-0,71 0,29 54 4 15г ое0 19 0,19-0,63 014"029 О,ЗВ о,г 0,34 0,19-0,72097 О 75 20 19 54 5 фермен- тированная ло" 019 012-021 0,21 0,11-0,29 налипая,0,05 Х 6 То ае,ггооО 19 54 О, О 3-0, 19 О 01-0,11002 010 0,02-0,11 0,05 0 93 0 79-2 00,07 0,03-0,090,92 0,81-2,0О 07 О 02-009 54 Серопозитивиые Серонегативные Серопозн- тнвиые О,О 4 54 0;06 54 7 То ве 3 Х 19 О,О 5 19 Сдронегативные П р и м е р 4. Выполняют в точном соответствии с предыдущим примером, исследуя тот же материал на наличие антител к ВИЧ, Отличие состоит в том, что для получения твердофазного анти- гена используют антигенные детерминанты ВИЧ из иммунодиагности:,. кой тестсистемы "Пептоскрин". Получают следующие результаты: из 100 исследуемых ВИЧ положительных сывороток известным способом правильно тестируют 88 (887), 12 сывороток (127) тестируют как отрицательные. Все сыворотки здоровых доноров и беременных женщин известным способом тестируются как отрицательные.Предлагаемый способ правильно тестирует 98 ВИЧ-положитепьных сывороток из 100, те. точность способа повышается до уровня рекомендованного комитетом экспертов Всемирной Организации Здравоохранения, Сыворотки здоровых доноров и беременных женщин тестируются без ошибок как отрицательные,Таким образом, выполненные примеры демонстрируют повьппение точности ИМ. Кроме того, важными являются еще два результата - снижение уровня фонового сигнала в ИФА и снижение его трудоемкости за счет устранения операции промежуточного разбавления исследуемой сыворотки). Способ осуществим при определении антител различной специфичности и различных биологических видов.10Формула изобретения Способ определения антител в твердофазном иммуноферментном анализе, 15 включающий сорбцию антигена на твердой фазе, внесение исследуемых антител и детекцию комплекса антигенантитело в пробе с помощью обработки раствором конъюгата белок А-перок сидаза и спектрофотометрической регистрации продукта пероксидазной реакции, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью повышения точности определения после внесения исследуемы 7.25 антител в пробу добавляют раствор,содержащий 0,5-2,0 М мочевину и обработанную пепсином сыворотку кровимлекопитающих й концентрации 1-23 за в раствор конъюгата вносят мочеви ну в концентрации 0,2-0 з 5 11."Опыт Од 492 ,Все го Все го Характеристикасыворотки в РР Всегополовительнык Характеристика ис 1 следуевк сывороток крови доноров по данным био- пробы рннт соеьн- отрнцетельнык телъъик Пределыколебаний Пределыколебаний составе 0,46 0,29"0,53 0,39 0,28-048 0 17 0,12-0,24 0,1 0,09"0,12 8 То ве 12 Сероповибев моче- тинные вины в РР Серонегатнвные 9 Прототнп Сероповнтнвные0,092 0,89-20033 0,29-0,4905 1 0,31 -0,92 5 2 19 19 19 0,18 О 12 "0,21 0 0 П р и м е чн и е: ОДПЭЯ- оптическая плотность продукта реакции при длине волны 492 вм; Н - мода - сРедний уровень ОД 49 В по группе сыворотки. таблнца 2 ОДяя 1Пределыколебаний"Опыт" фермеитнроваинаясывороткав РР ХоицептрациямочевиВецес тво, в симое в РР и его концентрациямольл ПопоСомОтрицантельряс творекоиъигатамолэл 1 Ночевина 02 Лонадн 02 Яо 0,24 2 0 0,78-2,0 0,96 011-0,39 наяЪХ-иая ТокеКорректор С.Шекмар Редактор И.Келемеш Заказ 348 Тирам 47 Подлис ное ВНИИПИ Государственного комитета ло иэобретениям и открытиям лри ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раущская наб а д. 4/5 Проиэводственно-иэдательский комбинат "Патент", г,Уагород, ул. Гагарина,10 2 То ке3 -4 -5 Ф6789 Оя1314 -Я 1516 -7 -18 0,5 О,д 1,0 1,5 2,0 2,2 2,а 0,3 О 5 1,0 2,0 2,3 1,5 То иея ФФ0,2 0,2 02 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 02 0,2 0 0,1 0,2 0,5 0,7 1 093 0,89 0,91 0,89 0,86 0,70 0,51 0,32 1,14 0,83 0,82 0,61 0,910,93 0,89 0,82 0,3 0,75-2,0 0,71-2,0 0,70-2,0 0,68-180 0,51 - 1,80 0,39-1,18 0,25-0,7 О,дд,0 0,85-2,0 0,79-1,94 0,80-176 0,31-0,91 0,72-20 0,71-20 0,70"2,0 0,71-2,0 0,4 д,6 0,12 0,11 0,10 0,09 0,1 1 0,090,070,26 0,14 О,О 0,11 1 Ъ,12 0,22 016 0,09 0,09 0,07 0 г 8-О 18 004-0, 15 0,03-0,12045-0,18 0,04-0,18 0,03-Ъ,16 0,04-0,13 О, 19-0,33 О,0-0,7 006-0 16 0 09-0 13 0,07-0,16 0,16-0,2 о 0,12-0,28 0,07-0,1 1 0,07-0,12 0,03-0,09 51 51 51 51 51 50 48 50 51 51 51 49 ад 50 51 51 5 0 0 О 0 Ъ 0 и П Ъ 0 1 ФЪ 1 20