Способ определения ассоциированного с беременностью протеина-а

(51) 5 6 01 й ЗЗЙ.1 ЕТЕНИЯ К А гепари ологиче в течен эации лмывею ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР АНИЕ ИЗО ОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 121) 4675094/1422) 06,04,89 46) 07.09.91. Бюл, М ЗЗ(71) Новокузнецки институт усовершенствования врачей(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АССОЦИИРОВАННОГО С БЕРЕМЕННОСТЬЮ ПРОТЕИНА-А(57) Изобретение относится к медицине, биологии. а именно к определению ассоциированного с беременностью белка протеина-А в различных биологических жидкостях и эксИзобретение относится к медицине, биологии, а именно к биохимии и иммунологии, и может быть использовано в акушерстве, гинекологии, онкологии при определении концентрации ассоциированного с беременностью протеина-А в различных биологических жидкостях и экстрактах тканей.Целью изобретения является повышение чувствительности способа, а также сокращение времени анализа,Способ осуществляют следующим образом.Вк аждую лунку полистиролового план- носят 0,2 мл раствора (15 мкг/мл) на в забуференном фосфатами физиском растворе с рН 7,0 и инкубируют ие 1,5 ч при 37 С, После сенсибилиунок и в дальнейшем планшеты прот эабуференным фосфатамитрактах ткани. Цель изобретения - повышение чувствительности и сокращение времени анализа, В каждую лунку полистиролового планшета вносят по 0,2 мл раствора гепарина (15 мкг/мл), инкубируют в течение 1,5 ч при 37 С, отмывают. Затем вносят разведение исследуемого материала, инкубируют, отмывают, В дальнейшем инкубируют со специфическими антителами с последующим определением концентрации белка путем соотношения оптической плотности в опытной пробе с калибровочными, В сравнении с прототипом увеличивается чувствительность способа в 20 раэ, а длительность анализа сокращается в 10 раз физиологическим раствором с рН 7,4, содержащим 0,1-ный твин, не менее трех раз. Для предупреждения неспецифического связывания в лунки вносят по 0,2 мл 1;-ного раствора бычьего сывороточного альбумина в забуференном фосфата,. ми физиологическом растворе (рН 7,4) иинкубируют 30 мин при 37 С, Затем лунки промывают.Калибровочные разведения стандартной смеси сывороток крови беременных женщин с известной концентрацией ассоциированного с беременностью протеина-А вносят в лунки двух рядов с дублированием каждого разведения. Исследуемые образцы биологических жидкостей или экстрактов тканей помещают в остальные лунки планшета, Обьем антигенсодержащих растворов составляет 0,2 мл. Инкубацию проводят в течение 1 ч при 37 ОС. После инкубации иОтмыВки планшета в лунки вносят пО 0,2 мл раствора кроличьих моноспецифических эффиннО Очищенных энтител поотиВ Эссо циированного с беременностью протеина-А В забуферном фосфатами физиологическом растворе(рН 7,4) в концентрации 40 мкггмг 1 и И 1 кубирут планшет в гсчение 2 ч призатем. планшет отмывают.В лунки вносЯТ по 0,2 мл козьих антител против иммуноглобулинов .:ролика, конъюгированных с пероксидазой из хрена, в рабочем разведении 1,1000 в забуференном фосфвтами физиолагицескс м растворе, рН 7,4, и выдерживакп в ечение 1,5 ч при,37 С, после чего пганшет промывают, За, тем в лунки вносят 0,15 мл субстратного оаствора рН 5,0(0,05 М лимонной кислоты, 0,1 М двухзамещенного фосфата натрия, 0.,04-ного ортофенигендиаминэ и 0,012-ной перекиси водороде), Ферментативное окисление субстрата при участии иммобилизованной пероксидазы из хрена проводят втечение 30 мин при 20 С с защищенном от света месте, Реакцию останавливают добавлением 0,05 мл 2 М серной кислоты. Относительную оптическую плотность содержимого каждой лун ки определяют спектрофотометрически при длине волны 492 нм по отношени 1 О к контрольным лункам, вкоторые вместо антигенсодерх эщих растворов вносят забуференный фосфатами физиологический раствор (рН 7,4).П р и м е р 1. Проводили определени концентрации ассоциированного с бере менностью протеина-А в сыворотке крови небеременной женщины М 28 лет, донора со станции переливания крови. Предвари.тельно В лунки планшета Вносят 0,2 мл рэс.твора (15 мкггмл) гепарина в забуферном фосфатами физиологическом растворе (хлористый натрий 8 г, однозамещенный фосфэт калия 0,2, двузамещенный фосфат натрия 2,9, хлористый натрий 0,2. дистиллирован ная вода до 1000 мл) с рН 7,0 и инкубирую 1 его 1,5 ч при 37"С, Для промывки лунок используют забуфе реннь 1 й фосфатэми физиологический раствор с рН 7,4, содеркащий 0,1-ный твин 20, причем промывку производили на этом этапе и в дальнейшем троекратно.Для предупреждения неспецифическо- ГО сВЯЗЫВэниЯ В лунки ВнООЯт 0,2 мл 1,(-но.го раствора бычьео сывороточного эльбумина в забуференном фосфатами физиологическом растворе (рН 7,4) и инкубировали 30 мин при 37 С. Затем лунки промывают. Для построения калиброаочнс 1- го графика В 9 лунок двух рядов вносят разведения стандартной смеси сывороток крови беременных женьцин (11 триместр беременности) с исходной концентрацией ассоциированного с беременностью протеина-А 80 мкг/мл, измеренной с помощьюметодов кол ичествен ного иммуноэлектро 5 фоооэа,Разведения смеси сывороток в забуференном фосфатвми физиологическом растворе ,ОН 7,4) были следующими, нг/мл:2000; 1000; 200; 100; 20; 10; 2; 1; 0,5, В лунки10 их вносят в объеме 0,2 мл. В две лунки этогоже планшета вносят по 0,2 мл сывороткидонора Ма еще в две лунки вносят по 0,2мл забуференного фосфатами физиологического раствора (рН 7,4) и используют по 15 сгедние в качестве контроля, Инкубациюантигенсодержащих и контрольных растворов проводят в течение 1 ч при 37 С.После инкубации и отмывки в рабочиелунки вносят по 0,2 мл раствора кроличьих20 моноспецифических афинно очищенных ан-.тител против ассоциированного с беременностью протеина-А в забуференномфосфатами физиологическом растворе (рН7,4) в концентрации 40 мкгlмл и оставляют25 планшет на 2 ч при 37 С, проводят отмывкупланшета. Затем в рабочие лунки вносят по0,2 мл козьих антител против иммуноглобулинов кролика, конъюгированных с пероксидазой из хрена в оаэведении 1:1000 в30 забуференном фосфатами физиологическом растворе (рН 7,4) и выдерживают 1,5 чпри 370 С, госле чего планшет промывают.Затем в рабочие лунки вносят по 0,15 млсубстратного раствора, рН 5,0 (0,05 М ли 35 монной кислоты, 0,1 М двухзамещенногофосфатэ натрия, 0,04;4-наго ортофенилендиамина и 0,012-ной перекиси водорода).Зту стадию ферментативного окислениясубстрата при участии иммобилизованной40 перрксидазы из хрена 1 проводят в течение30 мин при 200 С в защищенном от светаместе.Оптическую г 1 лотн Ость содержимогокаждой лунки, в которую вносиг 1 и калибро 45 вочные разведения стандартной смеси сывороток и сыворотка крови исследуемогодонора, определя 1 ат ггри длине волны 492нм по отношению к контрольным лункам, вкоторые вносился забуференный фосфатэ 50 ми физиологический раствор (рН 7,4). Получены следующие значения относительнойоптической плотности (в единицах оптической плотности) для калибровочных разведений: 2000 нг/мл - 0,728, 0,722; 1000 нг/мл -55 0,677, 0,674; 200 нг/мл - 0,530, 0,533; 100нг/мл - 0,479, 0,480; 20 нг/мл - 0,382, 0,383;10 нг/мл - 0,338, 0,338; 2 нг/мл - 0,216,0,215; 1 нг/мл - 0,174, 0,174; 0,5 мг/мл -0,050, 0,05, На основании этих данных былпосроен калибровочный график, отражаю1675773 дальнейшие этапы анализа и их продолжительность соответствовали примеру 1, Полуцены следующие значение относительной оптической плотна ти (в единицах оптической плотности) для калибровочных разведений: 2000 нгмл - 0,718, 0,724; 1000 нг/мл - 0 680, 0,670; 200 нг/мл - 0,541, 0,538; 100 нг/мл - 0,482, 0,481; 20 нг/мл - 0,378, 0,380; "0 иг/мл - 0,342, 0,342; 2 нг/мл - 0,210, 0,212; 1 нг/мл - 0,179, 0,176; 0,5 нг/мл - Я.,048, 0,050, Нэ основании этих данных был 5 10 построен калибровочный график. Относительная плотность содержимого лунок, в которые вносился экстракт яичниковсй ткани, равнялась 0,244 и 0,250. что соответствует на калибровочном графике концентрациям эс."сциированнсго с беременностью протеииэ-А 3,9 и 4,0 нг/мл, После усреДнения результатов двух параллельных исследоваэкстракте яичника ткани, взятой у больной Мравняется 3,95 нг/мл.Использование изобретения существенно расширяет возможности применения иммунсферментнсго метода в широкой клинической и нэуцнс-исследовательской практике, Достигнуто значительное (в 20 раз) повышение чувствительности иммуноферментнсго способа определения концентрации асссциирсвгннсго с беременностью протеина-А в различных биологических жидкостях и экстрактах тканей. По иэвест 30 ному способу цувствительнссть составляет 10 н г/мл, э по предлагаемому 0,5 нг/мл. Это сочетается с десятикратным сокращением 35. времени проведения анализа (по известномллительность анализа составляет 72 ч, а по предлагаемому способу 7 ч).Формула изобретения. Способ определения ассоциированного 40 с беременностью протеина-А путем иммуноферментиого анализа с использованием сенсибилиэированной твердой подложки и определением концентрации протеина-А по величине оптической плотности, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа и сокращения времени анализа, твердую подложку сенсибилизируют. гепарином. 45 50 Составитель В. ЛитовченкоРедактор М. Бланар Техред М.Моргентал Корректор О. Куидрик Заказ 2998 Тираж 386 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 щий зависимость между относительной оптической плотностью содержимого лунок и соответствующей концентрацией в них ассоциированного с беременностью протеина-А, Относительная оптическая плотность содержимого .лунок, в которые вносилась сыворотка крови женщины - донора, составила 0,404; 0,409, что соответствует на калибровочном графике концентрации ассоциированного с беременностью протеина-А 38,0 и 38,2 иг/мл, среднее значение результатов анализа 38,1 нг/мл. Продолжительность всего анализа равнялась 7 ч,П р и м е р 2, Поовсдят измерение концентрации ассоциированного с беременностью протеина-А в моче беременной Н 28 лет, 30 недель беременности. Предварительно мочу центрифугируют и фильтруют. Вседальнейшие этапы анализа и их продал. жительность аналогичны примеру 1, Получены следующие значения относительной оптической плотности для калибровочных разведений: 2000 иг/мл - 0,719, 0,728; 1000 нг/мл - 0,675, 0,679;, 200 нг/мл - 0,529, 0,531; 100 нг/мл - 0,490, 0,490; 20 нг/мл - 0,384, 0,379; 10 нг/мл - 0,342, 0,346; 2 нг/мл - 0,210, 0,211; 1 нг/мл - 0,170, 0,170; 0,5 нг/мл - 0,048, 0,049, На основании этих данных был построен калибровочный график. Относительная оптическая плотность содержимого лунок, в которые вносилась моча беременной Н., сказалась 0,355 и 0,356, что соответствует концентрации ассоциированного с беременностью протеина-А 15,6 иг/мл.П р и м е р 3, Проводили определениеконцентрации ассоциированного с беременностью протеина-А в экстракте яичниковой ткани, взятой у больной М 31 г., оперированной по поводу поликистоза яичников. Предварительно кусочек яицниковой ткани массой 0,5 г гомогенизировали в присутствии 1,5 мл забуфереиного фосфатами физиологического раствора (рН 7,4), содержащего соевый ингибитор трипсина в концентрации 10 мкг/мл, затем гомогеита поместили на 18 ч в холодильную камеру при 4 С, после этого его отцентрифугировали, а супериатант профильтровали для полного отделения от фрагментов ткани. Все 20 ний находим, что концентоация ассоциированнс 1 о с беременностью протеина-А в