Способ определения количества меченых клеток

СОЮЗ СО 8 ЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК эцио О 01 М 33/5:.3 Е ИЗО СПИ ГОСУДАРСТ 8 Е ННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Всесоюзный научно-исследозатзл кий институт биологического приборостроения и Институт иммунологии(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА МЕЧЕНЫХ КЛЕТОК(57) Изобретение относится к области иммунохимии и иммунологии и к исследованиям биологического материала путем автоматического анализа его взаимодействия с флуоресцентной меткой и может быть использовано в иммунологии и иммунохимии при проведении научных исследований. Целью изобретения является упрощение и повышение точности определения количества меченых клеток относительно их общего количества, Способ включает инкубацию пробы с флуоресцирующим индикаторным Изобретение относится к иммунохимии и иммунологии, в частности к способам автоматизированного анализа взаимодействия биологических клеток с индикаторными частицами, мечеными флуорохромом.Целью изобретения является упрощение и повышение точности определения количества меченых клеток относительно их общего количества.Ы 1675772 материэлом, облучение возбуждающим светом И регистрацию флуоресцентной эмиссии с помощью сканирующего микрофлуориметра. В качестве флуоресцирующего индикаторного материала используют флуоресцентный латекс. а пробу дополнительно флуорохромируют. Затем проводят облучение возбуждающим светом в диапазоне длин волн от 360 до 480 нм с регистрациеи флуоресцентной эмиссии в диапазоне длин волн от 400 дл 550 нм и от 430 до 600 чм с регистрацией флуоресцентной эмиссии в диапазоне длин волн от 530 до 700 нм, затем полученные результаты сравнивают между собой и по результатам сравнения судя 1 о количестве меченых клеФ ток, связавшихся с флуоресцирующим ин дикаторным материалом, относительно общего числа клеток в пробе, Анализ проводят гомогенно, беэ разделения связавшегося и не связавшегося с биологическими частицами индикаторного материала, Способ прост в исполнении и позволяет помимо абсолютного количества связавших индика вай торные частицы клеток, определять их относительное количество в пробе, 4 ил,ч На фиг,1 изображена гистрограмма распределения по амплитуде сигналов от розеток тимоцитов мыши с флуоресцентными латексными частицами, мечеными пиронином Х при длине волны возбуждающего света 430-600 нм с регистрацией флуоресцентной эмиссии в диапазоне длин волн от 530 до 700 нм; на фиг,2 - гистограмма распределения по амплитуде сигналов от всех (как меченых, так и немеченых) биологиче 16"772ских клеток, Длина волны возбуждающегосвета 360-480 нсрегистр" ция флуоресцектной эмиссии 400-550 нм; на фиг.3 - гистограмма распределения сигналов по амплитудепри окраске тимоцитов флуоресцирующимиантителами по известному способу ,Возбу)хдение 360 - 480 нс и регист-ация 400550 к,:,:.нд фиГ,4- Гистограмма расгредепения сыгна"лов от сенсибилизированных латексных частиц до внесения тимоцитов,Гистрограмма распределения сигналовот розеток сенсиб)илиэигованных латак:.;,- н ых частиц с тимоцитами, несущими ,"пу 1, ,антиген при облучении их светом с длина,волны 430 - 600 нм преиму.цественко 503нм) и регистрацией флуоресцектной эмис.сии в диапазоне длин волн 530 - 700 км пре. имущественно 560 нм приведена на фиг,3,Количество импульсов в пике гистограммы (23 импульса) соответствует количе" "Оству латексных розеток в анализируемомпрепарате, При визуальном наблюдениивидны ярко-красные датексные розетки,. За.тем сканирующий стол возвращали В исходное положение и сканировали тот )к, ".5препарат при возб)у)кдени ) светом с длинойволны 360 - 480 нм (преимущественно 450нм). Флуоресцентную эмиссию регистриро"Вали в диапазоне длин Волн от 400 до 550нм (преимущественно 580 нм), При визуаль- ЗОном наблюдении видна ярко-зелена. флуоресценция тела тимоцитов.Количество импульсов в пике гисто раммь.(фиг,2, 25 импульсов ) соответствует Общемколичесту тимоцитов в анализируемОЙ проса. 35По результатам сканирования вычисляли Отношение количества тимоцитОВ, несущих тЬу 1,1 антиген, к общему количествую)тимоцитов в пробе: -,=100 =. 92 Р),.2540При выполнении анализа известнымспособом в качестве индикаторных частициспользовали моноклональные антителамеченые флуоресценэотиоциангтом(ФИТЦ).ГистоГрамма сип адо 1)получаемых Г рисканировании тимоцитов, обработанныхспецифическими антиталами, меченьииФИТЦ, представлена на Оиг,З,П р и м е р 1. Примером пробы, содеожащей биологические клетки, является сус -пензия тимоцитов мыши В забуферномфизиологическом растворе рй 7,4,Индикаторные частицы, меченые фл орохрбмом, получали наг)еванием кб,р.но" 55го раствора меламина в Зф,-ном раствореформальдегида сдобавлением 10 - 160 мфлуоресцентного красителя пиронина,)КНагревание проводи.и на кипящей водянойбане до помутнения,Полученну)о, таким образом, суспензию монодисперсных флуоресцирующих латекскых частиц отмывали декантацией и сенсибилизировали мОноклональными антителами к Йу 11 антиГену путем ковал 8 нг" ного присоединения их с помощью гдутарового альдегида.Сенсибилизированные флуоресцирующие индикаторные частицы добавляли в гробу, содержащую тымоциты мыши линии СВД В концентрации 1 х 10 кл/мл из Оасчета ЗОО индикаторных частиц на 1 тимоцит.7 имоциты инкбировали в течение 1 ч, ГГЭСЛ 8 Ч 8 ГО ПРОВОДИЛИ ОбрабОтКу ИХ ГдутароЭь.м аЛЬД 8 гидом, ДОбаля ЕГО К Проба ДО конечной концентРации 0,2 Ур.Пробу инкубыровали с глутаровым альдегидом а -;ечение ". ч. После чего каплю суспенэии накосили на предметное ст 8 кло, накрывали покровным стеклом и края стекла парафинировали.Пол,чек нь: й таким образом препарат а н,) лизи рова ли с помощью ми крофлуориметра Ортов со сканирующим столом. Обработку сигналов проводили с помощью комп ьюта ра й/аг 9-720,По,дак;"ым сканирования при проведении анализа извес гным способ)ом, можно установ 1",ть абсолютное количество меченых тимоцитов В пробе ,3), но н 8 льзя ОпреДВ- дить их относительное количество Гсм, таблицу 1),Иэ гистограммы (фиг,4) видно, что сигналы от несвязавши:ся латексных частиц легко От,".,Ифференцировать от сигналов ла;акскых розеток по эмглитуде МР). Поэтому анализ по предлагаемому способу гроводится Гомогенно, беэ удаления непрореагировавших индикаторных частиц, меченых флуорохромом, что снижает трудоемкость проведения анализа в сравнении с известным способом, в котором несвязавшиеся флуоресцирующие индикаторные частицы неооходимо удал ить (Яды рацией либО многократн,ым цечтрифугированием,П - и м 8 р 2. о ка-,естве поим 8 ра пробы, содержащей биологические клетки, использовалась суспензия перитонадьных макро- )агов мыши линии СБА в соеде 199 с О /р-ной инактивиРованной сывоРотки :аепно:-о рогатогс ск,:та.Индикаторнь,е частицы получали как Описано В примере , НО Н 8 подв 8 рГали с 8 Н- сибилиэации антит 8 лами.2 мл суспензии макрофагов с концентрацией 1 х ;О кл/мл аслаивали на поверхность пластиковой чашки Петри диаметром 40 мм и инкубировали в течение 1 ч Затем :ав)ку ополаскивали средой 199, наслаивали на ПОВерхнОсть О.)разовавшегося на 881675772 ФЧ - .100) = 75. маметчик возбуждения и регист а ии самих клеток е может быть в пол неноее количество ти итов в пробе (25) дне монослоя макрофагов 2 мл среды 199 с 10 сыворотки крупного рогатого скота и вносили индикаторные латексные частицы из рас,етв 200 частиц на 1 макрофаг.Ь крофаги инкубировали с латексом с течение 2 ч, затем ополаскивали чашки Петри эабуференным Физиологическим растворомвысушивали и сканировали с помощью микрофлуориметра Ор 1 оп с обработкой сигналов на компьютере УУап 9-720,По результатам сканирования при возбуждении 430-600 нм и регистрировали флуоресцентной эмиссии при 530-700 нм судили об абсолютном количестве макрофагов, поглотивших латексные частицы (50 шт),По результатам сканирования при возбуждении 360-480 нм и регистрации флуоресцентной эмис ии при 400-550 нм судили об общем количестве макрофагов в пробе (67 шт,),По полученнымданчым определяли отношение макрофагов, поглотивших индикаторные частицы к общему количеству макрофагов в пробе - фагоцитарное число (ФЧ): Эагоцитарное число является показателем функциональной активности макрофагов и может измениться, в частности. под воздействием иммуномсдулирукщих веществ.П р и м е р 3, Анализ выполняется аналогично описанному в примере 1, но при получении индикаторных частиц в исходную латексную рецептуру вносят взамен пиронина Ж 100 - 160 мг родамина 6 Ж,Предлагаемый способ значительно упрощает в сравнении с известным определение в пробе количества биологических клеток, связывающих флуоресцирующие индикатооные частицы, поскольку исключает необходимость удаления несвязавшихсяиндикаторных частиц.Предлагаемый способ в отличие от извь;.тного позволясг помимо абсолютного5 количества связавших индикаторные частицы;леток определять их относительное количество в пробе, что имеет важноезначение, поскольку для оценки функциона;ьного состояния клеток к иммунологии10 используются, именно, относительные показатели, позволяющие сопоставлять дан:ые опытов, полученных на пробах,содержащих различное количество клетокрробы от различных, больных, различных15 лабораторных животных, анализ динамикиизманечия количества клеток, экспрессируюших изучаемый рецептор под влияниемраз г-,ных иммуномодуляторов и т,п,),Формула изобретения20 Способ определения количества меченых клеток путем инкубации клеток с индикаторными частицами, меченымифлуорохромом, с последующим нанесениемна подложку и подсчетом флуоресцентно25 меченых клеток при помощи сканирующегомикрофлуориметра, о т л и ч а ю щ и й с ятем, чтс, с целью упрощения и повышенияточности определения количества меченыхклеток огносительно их общего количества,30 в качестве индикаторных частиц использук:т частицы монодисперсного латекса, окрашенные иренином Ж, или родамином 6 Ж,а после инкубации клеток с индикаторнымичастица,и их обрабатывают глутаровым35 альдегидом с последующим подсчетом меченых клеток при возбуждении светом сдлиной волны 430 - 600 нм и регистрацииФлуоресцентной эмиссии в диапазоне длинволн 530 - 700 нм, и подсчетом общего коли 40 чества клеток при возбуждении светом сдлиной волны 360 - 480 и регистрации флуоресцентной эмиссии в диапазоне длин волн400-550 нм, и вычислением относительногоколичества меченых клеток,ьтагы анализа при сканировании в дипазоне длин волн, оптимальном для: ительное количество тимоцитов, ну 1,1 антиген; 23:25 х 100 = 921675772 орректор О, Кундрик едактор М, Блана аказ 2998 Тираж 388 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям. при ГКНТ СССР 113035, Москва, уК, Рауаская наб., 4/5 Производственно.издателвский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 оставитель П, Бонарцехред М.Моргентал 5456 1811 РФ