Способ определения противопарагриппозных антител

н иц для исходного разведения 1:400.Высокие значения оптической плотности продуктов пероксидазной реакцииполучают, применяя концентрациюконъюгата, равную 80 нг/лунку, причем в буфер для разведения тест-сыворотки и конъюгата вводят 0,5 . альбумина и 0,1 . детергента тритона Х,После оптимизации условий количественного определения антител в ТФИФАля тест-сыворотки, используют аналоичные услов ия для полной рас титрови исследуемых сывороток с разнойстепенью активности. Затем проводят1 атематическую обработку результатовХФИФА на электронно-вычислительнойГашине с использованием регрессионно"о и рандомизированного анализов.При этом исследуемые пробы сьворогок предварительно разводят однократюо например, 1:3200), вносят одноазведение в лунки сенсибилизированцых парагриппозных антигеном поли -стирольных микроплат, инкубируют снтителами, мечеными ферментом пероксидазой, выявляют количество связав -1 егося конъюгата путем добавленияраствора субстратной смеси на основеО-фенилендиамина, корректируют реак -цию по оптической плотности (ОП)тест-сыворотки добавлением в ферментсубстратную смесь раствора с предварительно определенным содержаниемсерной кислоты и через 15-25 мин учитывают фотометрически результаты анализа, а количество антител в сыворотКе (титр сыворотки) устанавливают нопоказателю оптической плотности ОП490в данном разведении - непосредствен -но по диаграмме определения титра сыворотки.Выявлякт лунки, в которых послеприменения той или иной концентрациисерной кислоты оптическая плотностьповысилась до величин, обозначенныхйа диаграмме для данного разведениятест-сыворотки с известным титром .Затем готовят по одному разведениюисследуемых сывороток, проводятТФИФА, усиливают реакцию уже известным количеством серной кислоты, а количество противопарагриппоэных антител определяют в исследуемых сьворот -ках по диаграмме,П р и м е р, Проводят полную раствтровку исследуемых сывороток. ДляЭтого лунки полистирольных микроплатсенсибилизируют раствором антигена 5 10 4 5 20 25 ЗО 35 40 45 50 5 гглютпвируюшие ед. /лунку ) в течеоье 1 8 ч 11 ри 4 С после чего микро платы промывают дистиллированной водой, содержащей 0,05 тритона Х, В лунки плат, сенсибилиэированных антигеном, вносят по 100 мкл 32 раэве - денных с 1:400 до 1:409600 (с коэффициентом 2) исследуемые сыворотки и те ст-сыворотки. Г 1 икроплаты помешают на 1 ч при 37 С. Сыворотки разводят эабуферным физиологическим раствором, содержащим 0,5% альбумина и 0,1 тритона Х(ЗФРАТ) . После пятикратного промывания в микроплаты вносят по 100 мкл/лунку антивидового конъюгата в оптимальной концентрации (80 нг/лунку) на ЗФРАТ, За оптимальную концентрацию конъюгата принимается такая концентрация, при которой для тест- системы в разведении 1:400 образуются продукты пероксидаэной реакции с ОП, оравной 1,300-1,400. После инкубацииов течение 60 мин при 37 С и заключительного пятикратного промывания в лунки вносят по 100 мкл субстратного раствора. 0,4 мг/мл о-фенилендиамина и 2,4 мМ Е 0 в 0,15 К фосфатно-цитратном буфере рН 5,0. Результаты реакции учитывают при длине волны 490 нм (ОП 4 з ), используя автоматический считывающий фотометр МР 580 ("Дайнатех ), Титр сывороток (количество противопарагриппоэных антител) определяют методом соотношений (отношение величин ОП 4 эо положительной (П) и отрицательной (О) сывороток), Величину П/О выше 2,1 считают положительнойЗа титр принимают то ее наибольшее разведение, при котором П/О выше 2,1. С помошью рандомизированного анализа на ЗВМ СМопределяют наиболее информативные разведения, т,е, разведения, которые позволяют с наибольшей вероятностью различать сыворотки с различными титрами.Далее определяется статическая зависимость показателя ОП (У) от титра сыворотки (Е) и ее разведения (Х).В результате анализа строят диаграммы для определения титра сыворотки по величине ОП в одном разведении.Затем определяют количественное содержание противопарагриппозных антител но одному разведению сыворотки с использованием диаграммы.Для этого берут тест-сыворотку с титром антител 1:409600 и исследуемые сыворотки, которые разводят однократно, наприВсе сыворотки используют в одном разведении, нап риме р: 1: 3200. Вносят разведенные сыворотки в лунки микро- плат - по три лунки на каждую сьворотку. Вносят конъюгат А в разведении, указанном на этикетке. Вносят заранее подобранную усиливающую концентрацию серной кислоты (392 г/л). Получены следующие результаты: чений Титр сьвороткираз- по показателюле ОП по диаграм -исло- ме 15344 ме р, 1 3200к 3, 2 мл ЗФРАТ добавляют 1 мкл сыворотки и тщательно перемешивают) . Вносят в лунки микроплат, заранее сенсибилизированные антигеном, по 100 мкл сывороток в одном5 разведении 1:3200, на каждую сыворотку используют по три лунки микроплат, Далее реакцию ТФИФА проводят, как описано вьше. Учитывают результаты спектроФотометрически и определяют величину ОП в разведении 1:3200 для каждой сыворотки.В результате установлено, что для 1 -й сыворотки величина ОП равна 0,984; 1,000; 1,025. По диаграмме находят титр для этой сыворотки - 1:409600. Для 2-й сыворотки ОП равна О, 923; 0,879; 1,001, титр по диаграм,ме 409600. Для 3-й сьворотки ОП 20 Ор 825; 0,890; 0,81 0, титр по диаграмме 1:204800. Для 4-й сыворотки ОП 0,71 0; 0,789; 0,753, титр 1:102400, Для 5-й сыворотки ОП 0,570; 0,653;0,670, титр 1:51200. Для 6-й сьворот ки ОП 0,525; 0,555; 0,560, титр 1:25600..Таким образом, используя диаграмму, можно определить активность сыворотки по одному разведению. 30Для постановки опыта используют сухие конъюгаты в ампулах, которые разводят согласно этикетке, и определяют титры антител по диаграмме, корректируя величину ОП добавлением серной кислоты. Проводят ТФИФА как описано вьнпе, только используют тест-сыворотку и сухие серии коныогатов разного срока изготовления.Конъюгат А изготовлен эа полтора года до опыта, конъюгат В - эа 8 мес до опыта, конъюгат С - за 3 мес до опыта конъюгат Р - за 20 дней до опыта.Разводят тест-сыворотку 1:3200 и вносят по 1 00 мкл в 60 лунок микро 45 плат, заранее сенсибилизированных ан тигеном. Конъюгаты А, В, С и Р разводят согласно рекомендациям на этикетке и вносят по 00 мкл каждой серии50 конъюгата в 15 лунок, Получают следувшие показатели ОП:. Средняя из трех знаОП для сыворотки введении 1:3200 (посдобавления серной кты) 04 6КонъюгатЛ О, 134 - 0,150В 0,160 - 0,180С О, 200 - О, 240Р 0,360 - 0,400Для корректировки результатов ис 1пользуют растворы серной кислоты9, 6, 98, 1 96, 294 и 392 г/л, которые вносят в три лунки (каждой концентрации) для каждого конъюгата. Реакцию учитывают через 15 мин. Дляповышения показателей ОП тест-сьворотки, используемой в разведении1:3200, до величин ОП 0,920-1,040,соответствующих титру сыворотки1: 409600) по диаграмме, потребовалось для конъюгата А внести 50 мклсерной кислоты концентрацией392 г/л; для конъюгата В - 50 мклсерной кислоты концентрацией 294 г/л;для конъюгата С - 50 мкл серной кислоты концентрацией 196 г/л; дляконъюгата Р - 50 мкл серной кислотыконцентрацией 98 г/л,Таким образом, при использованиив ТФИФА конъюгатов разной активностипо тест-сыворотке подбирают необходимую концентрацию серной кислоты(19,6-392 г/л), добавлением которойкорректируют оптическую плотностьдля сыворотки с известным титром,Затем определяют количественноесодержание противопарагриппозных антител в неизвестных сыворотках с использованием конъюгата А и тест-сыворотки. Для этого используют шестьпротивопарагриппозных сывороток неизвестной активности и одну тест-сыворотку с титром 1:409600 и ОП, например, в разведении 1:3200, равной0,920-1, 040 по диаграмме,1534404 Р 26Р 28В 65В 4 0,512 0,416 1,010 О, 273 1;256001:128001:4096000:6400 Составитель В.Литовченко Редактор В.Петрами Техред М,Дидык Ко ррек то р С, ШекмарЗаказ 39 Тираж 502 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССРь 113035, Москва, Ж, Рауюская наб., д. 4/5 Производственно-иэдательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 Сыворотки У 26 и 4 подвергаются Дополнительно 1 полной раститровке в ТФИФА для подтверждения цифровых показателей данного примера. Оказалось, 10 что при полной раститровке титр сыворотки 9 26 равен 1:25600, а титр сыворотки Р 4 равен 1:6400. Таким образом, корректирующие концентрации серной кислоты способствуют повьппе Нию ОП в ТФИФА, что позволяет по ди-аграмме определить истинные титры сыно роток . 20С использованиемпредлагаемого способа возможно применение нестандарт 3Ных серий антивидового конъюгата. Из 25 серий конъюгата возможно было исользовать для выявления противопа 11 агриппозных антител все 002 этих ерий. По известному способу возможно использовать с целью выявления йротивопарагриппозных антител только 7 серий из 25, т.е. только 283. 30 Фо рмула изоб ре тенияСпособ определения противопарагриппозных антител, включающий сенсибилизацию ячеек микропанели антигеном, параллельное внесение в часть из них пробы с тест-сывороткой и проб исследуемых сывороток, инкубацию, добавление эталонного антивидового конъюгата, измерение оптической плотности раствора и определение титра антител по диаграмме зависимости показателя оптической плотности от титра антител, отличающийся тем, что, с целью повьппения эффективности способа за счет использования нестандартного конъюгата, перед измерением оптической плотности в пробу с тест-сывороткой и конъюгатом вносят порционно раствор серной кислоты до достижения оптической плотности эталонного конъюгата и далее в пробы с исследуемыми сыворотками и конъюгатом вносят такое же количество серной кислоты и инкубируют в течение 15-30 мии.