Способ проведения иммуноферментного анализа

СОЮЗ СОВЕТСКИХо,айиРЕСПУБЛИК ОЮ 01). нский инст Юлаев,н,в 48-1851 2-0,4 рода ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ССОРИ ОТКРЫТИ(54)(57) 1. СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ ИММУН ФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА, включающий ин. кубацию определяемого и меченого ан а)4 А 61 К 39/00 ь О 1 В 33/53 тигена или антитела с иммуносорбентом и электрохимическое определение концентрации ферментной метки, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повьппения чувствительности, упрощения и сокращения времени исследования, электрохнмическое определение осуществляют по продукту пероксидаэного окисления йодид-,ионов перекисью водорода при рН 3,8-4,2.2. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, йодид-ионы берут в концентрации, ммоль:Иодид-ионы 0,75-1,5 Перекись вод1 1205913 2Изобретение относится к медицине центрации пероксидаз и биологической химии, в частности кера) наблюдается в к иммуноферментным способам опреде- центраций 110 - 1-м ления биологически активных веществ циент чувствительнос в сыворотке крови или другом биоло .1:10 мкА/ммоль. Числ3гическом материале, и может быть руемых с помощью про использовано в клиникодиагностичес- метрического датчика ких лабораториях и предприятиях Мин- Предложенный спос медпрома. делять до 25 нг/мл а-оЦель изобретения - повышение чувст( 2 1 О М) в сыворот вит ельности , упрощение и сокращение 50 мкл, дает возможн времени исследования при детектиро- в кинетическом режим ванин результатов иммуноферментного жает время измерений анализа. Результаты опредеСпособ осуществляется следующим 15 зы в модельных раств образом. табл,1Иммуноферментное определение П р и м е р, Имму аспарагиназы. деление кроличьих анКоличественное определение аспа- руса Х-картофеля. рагиназы проводят. прямым конкурент В основу метода и ным методом. В лунки планшетов для метод, который осуще иммунологических. реакций вносят по дующей схеме. 0,2 мл 100 мкл 9-глобулиновой фракции ан- го вируса (100 мкг/м тител против аспарагиназы содер- жи полистироловых плУожащей 0,1 мг/мл белка. Планшеты ин При 4 С в течение 18 кубируют 18 ч при 4 С, затем прово- аза 0,01 М калий-фо дят пятикратную промывку забуферен- при РН 7,4, содержа11ным физиологическим раствором при гента Твин. Пос РН 7,4. В лунки, содержащие иммо- кубируют иммобилизов ,50 мкл анализируемой пробы и коньюгата аспарагинаэы с пероксидазой, со а затем. с меченой пе ответствующего 10 мкг/мл нативной, фРакцией ослиной ант пероксидазы. После трехчасовой инку- ротки (5000 нг/мл), бации при 37 С лунки опять отмывают35процессе анализа про физиологическим раствором при РН 7 4 калий-фосфатным буфе содержащим неионный детергент О, 1 М хлористый натр (0,053 тритона Х - 100). В отмытые гента "Твин"Пос лунки вносят по 150 мкл субстратной чество сорбированног смеси содержащей 0 2 ммоль перекиси ного комплекса опредФ Э 40водорода и 0,75 ммоль иодистого ка- чески. В лунки добав лия, приготовленной в 0,1 М натрий- стратной смеси, соде ацетатном буфере при РН 3,8 с 0,1 М пеРекиси водорода и 1 добавкой хлористого калия. После стого калия, пригото 15-минутной инкубации при комнатной натрий-ацетатном буф45температуре 100 мкл пробы с помощью 0,1 М .добавкой хлорист автоматического микродозатора вводят 15-минутной инкубаци в проточный амперометрический датчик. температуре 100 мкл п В датчике продукт ферментативной реакции - молекулярный иод, электро- восстанавливаясь на поверхности индикаторного электрода, вызывает появление тока во внешней цепи датчика,фвеличина которого пропорциональна концентрации связанной с твердой фазой пероксидазной метки.Установлено, что линейный участок зависимости катодного тока от коны (фермента-маринтервале кон 10 М; Коэффити околоо проб, анализиточного амперв 1 ч, равно 60-80.об позволяет опреспарагиназыке крови объемомость работатье и в 3-5 раз сни 1ления аспарагинаорах приведены вноферментное опретител против виоложен сэндвич-.ствлен по слепробы очищеннол) вносят в лунат, инкубируютч. Отмывают трисфатным буферомщам 0,057 детерледовательно ин-.анный препаратниями исследуефС в течение 1 ч,роксидазой ЛКСикроличьей сывоОтмывку лунок вт 0,01 Мром, содержащимй и 0;053 детерле отмывки колио иммуноферментеляют амперметриляют 150 мкл субржащей 0,4 ммоль,5 ммоль иодивленной в 0,1 Мере при 4,2 сого калия. Послеи при комнатнойробы с помощьюавтоматического микродоэатора вводятв проточный амперометрический датчик.50Результаты, полученные предлагаемым способом, сравнимы по чувствитель ности с даннымиспетрофотометоичес кой регистрациии .значительно проще. Сравнительная характеристика элек" трохимических способов проведения им" муноферментного анализа (ИФА) представлена в табл, 2,+2,5 Т а б л и ц аВ Способ проведения ИФА с электрохимическойдетекцией Сравниваемый параметр предлагаемый известный НАДН - ф.НАД +2 е +Н(восстановление) Индикаторная реакция Двухэлектродная система с гальваническим Трехэлектродная системас наложенным потенциалом(фенитоин) 40 с 180 с Время измерения Составитель В. ДроздовТехред М.Надь Корректор С. Шекмар Редактор А. Козориз Подписное Заказ 8583/7 ТиражВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, И, Раушская наб., д. 4/5 а Филиал ППП "Патент", г. ужгород, ул, Проектная, 4 Диапазон определяемыхконцентраций продуктаферментативной реакции Коэффициент чувствительностиНижний предел определения фермента-маркера 116 + 7225 + 1160+ 5 т -55 .10 -5 10 моль/л (по Л) См= 1 10 Мили 0,5 нг/мл перок- сидазы