Способ получения растений-регенерантов ноrdеuм vulgare, устойчивых к токсическому действию ai в кислой среде

вая рН среды 4,8-3,8 соляной или серной кислотой,Низкий уровень рН определяет переход нерастворимых солей алюминия враствор с образованием А 1+, При выборе соединений алюминия следуетоценивать их не только как поставщиков катиона А 1+, но и с точки зрения присутствия в среде анионов дополнительно к тому минеральному составу, на основе которого приготовлена среда . Так, например, предпочтительнее использовать алюмоаммонийныеили алюмокалиевые квасцы, чем хлористый алюминий (избыток С 1 в среде нежелателен).При расчетах доз алюминия следуетиметь ввиду, что при повышении рНколичество катиона А 1+ в среде умень 20шается, при понижении увеличивается,Бсли при концентрации алюминия10 мг/л количество А 1" в среде прирН 4,5 составляет 3,6 10 смоль/л,то при 4,0-3,58 10 , при рН 3,5-3,6 е 2510 , а при рН 3,0-3,6 10. При предлагаемой концентрации алюминия (79 мг/л) фосфора выпадает в осадокпри рН 4,0-3,5 до 301 от исходногосодержания, что допустимо для развития растений-регенерантов. Чем нижерН среды, тем меньше образуется каллусов и регенерировавших из них растений. При рН 3,5 и ниже каллуснаяткань от первичной посадки не формируется или быстро погибает.Кроме того, агар-агар в кислойсреде не желируется. Плотную илижелеобразную среду в этом случаеможно получить, используя смесьагар-агара и желатина, который желируется в более кислых условиях. Достоинства этой смеси в том, что онадает плотную или желеобразную изотропную среду при кислом рН. Использование одного желатина невозможно,так как он образует при застываниигрубую ячеистую структуру, препятствующую контакту эксплантата со средой.Поскольку желатин после автоклавирования подщелачивает среду, рН средыперед автоклавированием должен бытьниже заданного для эксперимента.Яелеобразная.среда хорошо удерживает на поверхности эксплантат, позволяет наклонять и даже класть пробиркуво время работы.Для эксперимента берут три уровнякислотности сред: рН 4,8-4,1-3,8 в соответствии с классификацией почв на слабокислые с рН 5-6 серые лесные оподзоленные), кислые с рН 4-5 (дерновоподзолистые и подзолистые) и сильно кислые с рН 3-4 (торфяные и болотистые).Исходя из того, что свыше 503 почв Нечерноземной зоны имеют кислую реакцию, предлагается селективная среда для регенерации зерновых злаков из недозрелых зародышей с целью полученияформ, устойчивых к кислым почвам стоксическим действием алюминия (вмг/л):Среда Т (для инициации каллуса):макро- и микросоли по Иурасиге и Скугу; сахароза 20000-30000; агар-агар6000-7000; желатин 3400-3600; витамины по В. тиамин 1-10; миоинозитол80-100, пиридоксин - НС 1 0,5-1; нико-,тиновая кислота 0,5"1; дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4 Д) 2-3; А 1.+ 7-9;,ГКА 1(ЯО, ) 1.".НО 140-180.Среда ТТ (для получения регенеран,тов из каллуса); макро- и микросолипо Иурасиге и Скугу; сахароза 2000030000; агар-агар 6000-7000; желатин3400-3600, витамины по В: тиамин1-10; о" нафтилуксусная кислота (АНУ)О, 5-1; ки нети н О, 5-1; А 1+ 7-9КА 1 ( БО Ф) а 1 2 Н 20 140-180 1Для обоих сред устанавливается тризначения рН: рН,4,8 (готовой среды),рН 3,75 (перед автоклавированием);рН 4,1 (готовой среды), рН 3,0 (передавтоклавированием) рН 3,8 (готовойсреды), рН 2,7 (перед автоклавированием),П р и м е р 1 (контроль). Проводяткультивирование незрелых зародышейячменя на питательной среде следующего состава, в мг/л: макро- и микросоли по Иурасиге и Скугу; сахароза30000; агар-агар 7000; витамины поВ. тиамин 10, миоинозитол 100; пиридоксин - НСТ 1, никотиновая кислота1; 2,4 Д 3,0 (среда Т для инициациикаллуса) или АНУ и кинетин по 1,0=6,0,На среду Т высаживают незрелые зародыши 6 селекционных образцов ячменящитком вверх в возрасте 10-14 дней после опыления. Высаживают по 30 пробирок каждого образца по 8 зародышей в одной пробирке - всего 240 зародышей каждого образца. Через 7- 10 дней визуально на поверхности щит46483 10 15 20 55 515 ка отмечают образование каллуса и его последующее нарастание. В зависимости от генотипа процент образования каллуса составляет 373-75,53Каллусы находятся на этой среде до появления плотных участков - меристе матических очагов, после чего плотные участки переносят на среду для регенерации 1 1, на которой иэ них в течение 4-8 недель образовываются проростки, в зависимости от генотипа в 11-314 случаев; Оставшийся после переноса плотных участков на среду П каллус пересаживают на среду 1 для дальнейшего нарастания каллуса и формирования в нем новых меристематических зон.Возможно культивирование незрелых зародышей ячменя на питательной среде Мурасиге и Скуга со следующим содержанием добавок, мг/л: сахароза20000; агар-агар - 6000; витамины: тиамин 1; миоинозитол 80; пиридоксин - НС 1 0,5; никотиновая кислота 0,5; 2,4 Д 2 (для инициации каллуса) или АНУ и кинетин по 0,5 (для регенерации); рН 5,8-6,0.На этих средах получены результаты, аналогичные вышеприведенным, с той разницей, что при уменьшении количества 2,4 Д с 3 до 2 мг/л происходи ускорение во времени заложения меристематических эон. Эти данные дают возможность работать с селективными средами, в основе которых лежит среда следующего состава, мг/л: макро-. и микросоли по Иурасиге и Скугу;сахароза 30000; агар-агар 7000, витамины по В : тидмин 10 миоинОзитОл 100; пиридоксин - НС 1 1; никотиновая кислота 1; 2,4 Д 2 (среда для инициации каллуса) или РНУ 0,5; кинетин 1,25 ЗО т 35 40 45 50 Эту среду в дальнейшем называют основной. На основную среду накладываются предлагаемые факторы: А 1" и желатин при разных значениях рН.П р и м е р 2. Проводят культивирование незрелых зародышей ячменя на кислой селективной среде 1 с токсическим действием алюминия следующего состава, мг/л: основная среда, желатин 3600; А 1" 9; рН 4,8 (готовой среды); рН 3,75 (перед автоклавированием).На эту среду высаживают незрелые зародыши тех же 6 селекционных образцов ячменя щитком вверх в воэрасте 10-14 дней после опыления в количестве около 240 зародышей каждого образца. В зависимости от генотипа процент образования каллуса составляет15-703, что несколько ниже контроля.Процент заложения меристематическихзон снизился по сравнению с контролемв 2 раза и более и составил 4-163, чтосвидетельствует о токсичности селективной среды с содержанием А 1+ при рН 4,8.Не было получено принципиальных отличий по выходу каллуса и меристематических зон при культивировании зародышей на основной среде с содержанием желатина 3400 мг/л, А 14 7 мг/л при рН 4,8. Поэтому для проведения третьего и четвертого эксперимента было взято в дополнение к основной среде, мг/л: желатин 3500; А 1 8. Условия третьего и четвертого экспериментов были изменены за счет понижения рН среды,П р и м е р 3, Посадку зародышей и их культивирование осуществляют по схеме примера 2 на среде следующего состава, мг/л: основная среда; желатин 3500; А 14 8; рН 4,1 (готовой среды); рН 3,0 (перед автоклавированием).Как видно из вышеизложенного (с. 5), понижение рН увеличивает количество А 14 в среде, следовательно, повышает ее токсичность, При рН 4,1 среда с содержанием агар-агара и желатина не плотный нель, но застудневает;На селективной среде примера 3 получено в зависимости от генотипа при работе на тех же селекционных образцах: каллусов от числа посаженных зародышей 5,2-27,84, каллусов с меристематическими зонами 0,9-6,23, т.е. имеет место дальнейшее понижение процента выхода продукции.П р и м е р 4. Посадку зародышей и их культивирование осуществляют по схеме примера 2, рН сред составляет 3,8. Эти среды желеобразны и для удобства работы на поверхность их кладут диск Фильтровальной бумаги.На селективной среде примера 4 получено каллусов от числа посаженныхзародышей 1,5-233, каллусов с меристематическими зонами 0,4-2,9. Кроменизкого заложения меристематическихзон токсичность сред примера 4 проявляется также в быстром потемнении и1546483 Формула и 3 о б р е т е н и я ь В. Демкин Корректор О, Ципле Редактор И, Киштулинец Техред А.Кравчук еее е е ее Заказ 56 Тираж 484 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 13035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 етте еПроизводственно-издательский комбинат "Патент", геУжгород, ул,Гагарина, 101 отмирании каллусной ткани. Кроме того, при потемнении каллусной тканиее сразу не выкидывают, так как плотные (меристематицеские) участки обна 5руживают иногда и на таком каллусе(очевидно, из более устойчивых клеток). В случаях, когда после заложения меристематицеских очагов или проростков на среде с рН 3,8 они останавливаются в росте и развитии, ихпересаживают на среды с рН 4,0-4,1 ивыше (т.е. на среды с менее жесткимрежимом).Дальнейшее понижение рН питательных сред нецелесообразно.,Проростки, полученные на селективных средах примеров 2 е 4, отсаживают наобычную среду для ускорения и последостижения регенерантами фазы 2 т 4 20листьев высаживают из пробирок сначала в горшочки с землей, а затемв поле, где они завязывают зерно.Всего от 6 селекционных образцовячменя получено на селективных средах 91 линия, в том числе на средес. рН 4,8 41, с рН 4,1 29, с рН 3,824П р и м е р 5. Посадку зародышейи их культивирование осуществляют 30по схеме примера 2, В качестве исходного материала берут зародыши от растений-регенерантов, полученных изкаллусной ткани на среде с рН 4,8(т.е. производится повторная посадка Э 5на селективную среду) .В эксперименте 5 на среде с рН3,8 получено от тех же селекционныхобразцов ячменя каллусов от числапосаженных зародышей 18-69,33, каллусов с меристематическими зонами 1,2193. Линий ячменя в грунте 92. Этотэксперимент свидетельствует,о том,что повторное культивирование населективных средах ведет к повышению 45устойчивости материала.1Предлагаемые среды дают возможностьв короткий срок (2,5 е 10 мес) отобратькаллусы способные формировать в жестУсвСоставител ких условиях эксперимента очаги меристемы с последующей регенерацией из них растений, т.е. более устойчивые к данным условиям, в то время, как менее устойчивые погибают на том или ином этапе эксперимента. Тем самым в 5-10 раз сокращается объем работ по оценке растений ин вива и значительно повышается возможность отбора устойчивых форм.Предлагаемые среды с учетом поправок, вносимых в зависимости от сортовой специфики, могут быть использованы в работе с другими злаковыми сельскохозяйственными культурами. Способ получения растений-регенеерантов Ногсецио чц 1 Каге, устойчивыхк токсическому действию А 1" в кислойсреде, включающий культивирование незрелых зародышей и получение из нихрегенерантов на питательной среде,минеральной основой которой являетсясреда Мурасиге и Скуга, содержащейдополнительно, мг/лСахароза 20000 е 30000Тиамин 1 е 10Миоинозитол 80"100ПиридоксинеНС 1 0,5 е 1,0Никотиновая кислота 0,5 е 1,0Дихлорфенилуксуснаякислота 2 е 3или с-нафтилуксусная кислота и кинетинпо 0,5-1,0Агар-агар6000 е 7000о т л и ч а ю щ и й с я тем, цто, сцелью повышения выхода устойчивых;растений, в среду дополнительно вводят алюминий в виде алюмокалиевых илиалюмоаммонийных квасцов в количестве7 е 9 мг/л, желатин в количестве 34003600 мг/л для создания желеобразнойконсистенции среды, устанавливая рНсреды 4,8-3,8 соляной или серной кислотой,