Способ получения протеолитических ферментов

(51) М. Кл. С 120 13/10 Государственный намитет Совета Министров СССР оо делам изобретений н открытий(72) Авторы изобретения М. 3. Закиров, С, С. Щелокова, Н. Н. Караваева и О. Хасанов Отдел микробиологии АН Узбекской ССР(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВя к ферментнои проИзобретение относитс мышленности,Известны способы по ских ферментов путем продуцентов на питате щей источники углерода учения протеолитичекультивирования их ьной среде, содержа и азота,10,50,50,03020. мооза, 3 В качестве продуцентов при известных способах используют термофильные грибы, огносяшиеся к виду Мцсог рцз 111 цз, Мупосое сцгп 10а 1 цотпусез и др.Предлагаемый способ позволяет получитьболее термостабильные протеолитические ферменты,Для этого в качестве продуцентов используют термофильный гриб, относящийся к видуТогц 1 а йегтпорЫ 1 а, в частности штамм УзПТ.Штамм Тогц 1 а йегтпорЫ 1 а УзПТцелесообразно культивировать на водной питательной среде, содержащей 20% спиртовой зерновой барды и 1,5 - 2% крахмала.Предлагаемый способ заключается в том,что штамм Тогц 1 а ЙегтпорИа УзПТкультивируют на водной среде, содержащей источники углерода и азота при рН среды 5,0 - 9,0,преимущественно 5,2 - 5,5, и температуре 28 -56 С, преимущественно 40 - 50, в течение 2 -4 суток.В качестве источника углерода в средегут быть использованы глюкоза, сахар мальтоза, лактоза, маннит, глицерин, декстрин, инозит, крахмал.В качестве источника азота может быть использован органический азот в виде пептона, кукурузного экстракта, дрожжевого автолизата, желатины, казеина, гемоглобина, яичного альбумина.Пример 1. Штамм гриба Тогц 1 а ЙегтпорЬ 11 а Уз-ПТкультивируют на водной питательной среде, содержащей 20% (объемных) спиртовой зерновой барды и 1,5 - 2% крахмала при рН - 5,5 и температуре 45 - 50 С в течение 2 - 3 суток.Протеолитическая активность полученной культуральной жидкости составила 1,5 - 2,5 ед/мл.Пример 2. Штамм гриба Тогца ВегтпорИа УзПТкультивируют при рН 5,2 - 5,5, температуре 45 - 50 С в течение 3 - 4 суток на среде, содержащей, г:КН 2 Р 04МФ 04КСГс 504 1 КрахмалКукурузный экстракт Среда также содержит до 100 мл воды, При этом получают культуральную жидкость, протеолитическая активность которой436853 Активность препарата, полученного из 1 л культуральной жидкости ед Выход, % к исходной активности Выход Удельная активностьБелок мг/л г/л 440 10-3 417 10 а 40 250 569 6,32 Осаждеиие этаиолом 417 Осаждение сульфатом аммо- ния 313 750 0,75 45 3по методу Ансона составляет 600 в 7 10- на 1 мл.Из культуральной жидкости протеолитические ферменты могут быть выделены путем осаждения их этанолом в соотношении 1: 4 Способ получения препарата препарата,Из таблицы видно, что хотя выход препарата при высаливании сульфатом аммония инебольшой, активность сохраняется полностью.Следовательно препарат получается в 8 -10 раз более очищенным, чем при осажденииэтанолом.Культуральная жидкость и ферментные препараты активны в пределах рН 4 - 12. Однаков кислой области протеолитическая активностьзначительно ниже, чем в щелочной. Максимумпри рН 10 - 11,При 50 С фермент утрачивает активностьна 50% за 6 час и на 75% за 24 час. При 56 Сактивность теряется на 50% за 1 час и на 75%за 6 час. При 60 С фермент инактивируе сяна 50% за 15 мин и полностью за 1 час 30 мнн.При 65 С активность исчезает за 55 - 60 мин(опыты проведены при рН 10). Протеолитические ферменты мезофильного гриба Азрегр 11 цзНачцз (Закиров М. 3., Умирзаков Б., 1966)полностью инактивируются в течение такогоже времени при 55 С (при рН 4,5).Характерист ика штамма Тогц 1 а1 Ь е г пт о р Ь 11 а У 3 П Т -1.Штамм выделен из лугово-болотной почвыОрджоникидзевского района Ташкентской области.Растет при температуре 28 - 56 С (оптимальная температура - 40 - 50 С) и рН среды5,2 - 5,5. На среде при рН ниже 5,0 гриб нерастет, а при 8,0 - растет, но протеолитическая активность культуральной жидкости постепенно снижается.На твердой среде Чапека с кукурузным экстрактом (2%) и крахмалом (3%) мицелийгриба бесцветный, ветвистый, септированный,диаметром 2 - 5 мк. Спороносные гифы мицелия распадаются на споры. Споры в цепочкахшаровидные, гладкие, просвечивающиеся, темно-коричневого цвета. Диаметр их 8 - 12 мк.Встречаются споры овальной формы размером7,0 - 9,0 Х 10 - 12 мк. Колонии через 2 суток сбелым воздушным мицелием, затем чернеют ичерез 5 - 7 суток становятся агатово-черными. или высаливанием сернокислым аммонием при70% -ном насыщении. Выход и активность полученных препаратовпредставлены в таблице. Среда Чапека с пептоном (1%), В двухсуточной культуре колонии белые, пушистые, кольцевидные, на третьи - четвертые сутки от кольца диаметром 2 - 3 см мицелий разбро сан в виде тяжей по всей поверхности питательной среды в чашке Петри. На пятые - седьмые сутки колония становится черной.Среда Чапека с пептоном (1% ) и крахмалом (3%) - (сахароза исключена), Через 15 двое в тр суток колонии бесцветные, кожиетые, выпуклые, вросшие в агар. На пятые - седьмые сутки колонии становятся черными.Края колоний неровные, поверхность бугристо-морщинистая, бархатистая.20 Сусло - агар. Через сутки начинается почернение мицелия, и в семисуточной культуре мицелий становится агазово-черным, бархатистым.На жидких вышеуказанных средах гриб об разует на поверхности черную пленку и рыхлый мицелий в толще среды. На пшеничных отрубях растет медленно. Через 8 - 10 суток отруби становятся черными.В качестве источника азота гриб использу ет органический азот в виде пептона, кукурузного экстракта, дрожжевого автолизата, желатина, казеина, гемоглобина, яичного альбу- мина. Наилучший рост гриба и биосинтез его протеолитических ферментов наблюдается на 35 среде с кукурузным экстрактом, слабеена среде с пептоном или дрожжевым автолизатом и еще слабее на других источниках азота. Очень слабо растет на средах с минеральным азотом.В качестве источника азота использует глю козу, сахарозу, мальтозу, лактозу, маннит,глицерин, декстрин, инозит, крахмал, Слабо растет на среде с арабиновой, раффиновой, рамнозой, дульцитом и сорбитом. Предмет изобретения 1. Способ получения протеолитических ферментов путем культивирования их продуцен436853 Составитель П, Полянская Техред 3. Тараиенко Корректор А. Дзесова Редактор А. Бер Заказ 3460/8 Изд.85 Тирак 456 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 тов на питательной среде, содержащей источники углерода и азота, с последующим выделением ферментов из среды, отличающийс я тем, что, с целью получения термостабильных ферментов, в качестве продуцентов используют грибы Тогц 1 а йеггпорЫ 1 а,2. Способ по п. 1, отличающийся тем,что из грибов Тогп 1 а йеггпор 1 п 1 а используютштамм УзПТ.3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийсятем, что штамм Тоги 1 а йеггпорЫ 1 а УзПТ 5 культивируют на водной питательной среде,содержащей 20% спиртовой зерновой бапдыи 1,5 - 2% крахмала.