Способ спектрального определения активности пептидаз

(71) Институт молеАН СССР(53) 655.4 (08 (56) Непйег Н, йс БиЪзггаЬез апй РЬгпо 1 у ЬоН РиЬ 1. 198Авторское с В 1359283, кл, С 07 С 143/60,.8)НапйЬоо 1 сЕог гЬе Со с Бузгеш. идетельств С 12 И 9/5 14.06,86,ог БупгЬ яц 1 аг 1 оп м. ицовытисти ОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ Изобретение относится к биохимии конкретнее к способам определения ферментов, гидролизующих амидные связи, и может быть использовано в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве, пищевой, гидролизной, фото- и микробиологической промышленности для анализа пептидаз.Целью изобретения являетса п шение точности и чувствительнос определения пептидазной активно ферментов.На чертеже приведен график определения чувствительности пептидаз.Целесообразно использовать метод флюоресценции для количественной ре гистрации продукта ферментативной реакции - 1-нафтиламин-сульфокислоты, образующейся при гидролизе(54) СПОСОБ СПЕКТРАЛЬНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПЕПТИДАЗ(57) Изобретение относится к анализупептидаз по флюоресценции продуктовреакции. Цель изобретения - повышение точности и чувствительности определения пептидазной активности ферментов. В качестве субстратов предложено использовать 1-аминоациламинонафталин-сульфокислоты. Продуктферментативной реакции - 1-аминонафталин-сульфокислоту определяютпо флюоресценции ( , 360 нм,Ъ505 нм) непосредственно в реакционной смеси. Флюоресценция субстрата (Ф 0 340 нм, %420 нм) немешает определению, 1 з.п. ф-лы,1 ил, 1 табл. субстратов-(аминоацил)-аминонафталин-сульфокислот.Для проведения анализа согласно способу. целесообразно использовать для возбуждения флюоресценции источник длиной волны .360 нм, а продукт реакции - 1-нафтиламин-сульфокис" лоту - определять при - 505 нм при этом флюоресценция субстрата ( Ъ , -340 нм, %,- 420 нм) полностью исключается, К реакционной смеси содержащей субстрат, буферные добавки, вещества, необходимые для нормальной работы фермента (например, комплексоны, ионы магния и пр.), добавляют известное количество определяемого фермента, смесь инкубируют при постоянной температуре, наблюдая за увеличением флюоресценции при1470766 Опыт фермент Буферныйраствор Время инкубации,позволяюВремя инкубации по прототипу, с Субстрат щее выявить ферментВизуально, с оназафцО 0,05 трис-НС 1, 2рН 7,6 60 ак в примере 1 600 0,05 М трис-НС 1,рН 8,0, 0,001 М,ЭДТА, 0,001 МдитиотреитКак в примере 10,066 трис-НС 1,0,05 М СаС 1,0,05 И БаС 1 Папаин к в приме" 1 25 600 37 1800 ифа) ромби Комплекспротеазсывороткикрови 25 го-Рпе- АгК-БН Компле протеа о же 505 нм, По интенсивности роста флюоресценции судят о количестве фер/мента. Можно также проводить измере 1 ния "по конечной точке", определяя флюоресценцию однократно по истечении определенного промежутка времени,П р и м е р 1. Определение активности трипсина по флюоресценции 1" 1-нафтиламин-сульфокислоты. 102 мл реакционной смеси, содержащей 510 М 1-(М-карбобензоксиаргинил)-аминонафталин-сульфокислоты в 0,05 М трис-НС 1 буфере, рН 8,2, помещают в кювету спектрофлюориметра, 15 добавляют 10 мкл исследуемого фермента и проводят измерение флюоресценции при 505 нм, - 360 нм, по отношению прироста интенсивности фпюоресценции к временному интервалу 20 судят о количестве фермента, используя в качестве эталона стандартную рипсин Тозил -р 1 у-Рго-Атц-МН кривую, снятую в тех же условиях при известных концентрациях стандартного раствора трипсина.П р и м е р 2. Определение активного тромбина по флюоресценции 1-аминонафталин-сульфокислоты. 2 мл 210 М раствора тозилглицил-пролил-аргинил"аминонафталин-суль" фокислоты в 0,05 М трис-НС 1 буфере, рН 8,2 помещают в кювету спектрофлюориметра, добавляют 10 мкл исследуемого образца тромбина, перемешивают и регистрируют рост интенсивности флюоресценции при 505 нм ( Э О 360 нм) во времени. Активность фермента определяют по тангенсу наклона касательной и кривой зависимости интенсивности флюоресценции от времени.Аналогичным образом может быть проведен анализ других пептидаэ, приведенных в таблице.023 НМ 00 Составитель И.ПриваловаТехред .Л.Сердюкова дактор Корректор С.Черни г аз 1551/29 Тираж 501 ПодписноеИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 В 3Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,10 б 14707Как видно из чертежа, максимумы чувствительности определения приходятся на длину волны эмиссии 505 нм, при возбуждении 360 нм отклонение от5 максимумов понижает чувствительность определения. Ф о р м у л а изобретения101. Способ спектрального определения активности пептидаз, предусматривающий измерение скорости ферментативного гидролиза аминоацильных производных 1-аминонафталин-суль 66ефокислоты с количественной регистрацией изменения спектральных характеристик реакционной смеси, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью повьппения точности и чувствительности определения пептидазной активности ферментов, количественную регистрацию проводят путем измерения интенсивности флюоресценции.2. Способ по п,1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что интенсивность флюоресценции измеряют на длине волны 505 нм при использовании источника возбуждения с Э 360 нм.