Способ определения активности фосфолипазы а

(19 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ М:Вф ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ ССС ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫ(71) Институт биоорганической химииАН БССР(56) Нааз С.Н.Пе, Розеша Н.М.,МецгхепЬц 1 яеп 11.,0 еепеп чап,Рцг 1 Ясагоп апй ргорегез оГрЬозрЬоБразе А Ггош рогспе рапсгеаз. - ВьосЬ. В 3.ормуз. Асса, 1968,ч. 159, р, 103-117.(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИФОСфОЛИПАЗЫ Ар(57) Изобретение относится к областибиохимии и биотехнологии, в частностик определению активности одного изважнейших ферментов липидного метаболизма - фосфолипазы А. Целью изобретения является повышение точности и упрощение способа определения. Способ осуществляется путем добавления в измерительную кювету спектрофотометра, содержащую мицеллярнуюформу субстрата яичный лецитин ихолат натрия в соотношении 1:2-4анализируемой фосфолипазы и кофактора-соль кальция, а в контрольную кювету - раствора гемоглобина и регистрации разностных спектров на двухлу"чевом спектрофотометре, При этом интенсивность спектра между максимумомпри 423 нм и минимумом при 405 нмпропорциональна количеству жирной кислоты, освобождаемой в результатеферментативной реакции. Отличительным признаком способа является специфичность комплексообраэования жирнойкислоты с гемоглобином, приводящегок изменению спектральных характеристик гемопротенда. 3 ил.1 13646Изобретение относится к биохимиии биотехнологии, а именно к определению активности одного из важнейшихферментов метаболизма липидов - фосфолипазы АЦель изобретения - упрощение способа определения активности фосфолипазы АСпособ заключается в том, чтоанализируемую пробу, содержащую фосфолипазу А , помещают в одну из кювет,в которых находятся мицеллярная форма субстрата (яичный лецитин и холатнатрия в соотношении 1:2-4), кофактор - соль кальция и гемоглобин, споследующей регистрацией разностныхспектров гемопротеида на двухлучевомспектрофотометре. При этом интенсивность спектра между максимумом при 20423 нм и минимумах при 405 нм пропорционапьна количеству жирной кислоты, освобождаемой в результатеферментативной реакции.П р и м е р 1, К 4 мг димиристоилфосфатидилхолина приливают 0,04 мп20%-ного холата Ба (молярное соотно-.шение липид/детергент 1;4) и 12,8 мп0,01 М трис-НС 1 рН 7,4 интенсивновстряхивают, добавляют 0,12 мп 30О,1 М СаС 1 и 1,2 мл раствора гемоглобина (3,37 10 М) в 0,01 М трисНС 1, рН 7.4. В опытную и контрольнуюкюветы помещают по 2 мл реакционнойсмеси, прописывают нулевую линию на 35приборе Бресогй, Реакцию начинаютдобавлением в опытную кювету 22 мклраствора фермента (исходная концентрация фермента 0,011 мкг/мл ), через2,4,6,8 и 10 мин регистрируют и.менения интенсивности между максимумоми минимумом в разностном спектре гемоглобина, На фиг.1 показано изменение интенсивности между максимумоми минимумом, которое через 2,4,6,8и 10 мин равно 0,02 Р, 0,035 Р, 0,06 Р,0,1 Р, 0,145 Р соответственно,Наблюдают рост интенсивности меж"ду максимумом и минимумом в разностном спектре гемоглобина в зависимости от времени ферментативной реакции(фиг,1).П р и м е р 2, Построение калибровочной кривой, К 4 мг димиристоилфосфатидилхолина приливают 0,04 мп20% холата 11 а (молярное соотношениелипид детергент 1:4), 12,8 мп 0,01 Мтрис-НС 1 рН 7,4 интенсивно встряхивают, добавляют 0,12 мл 0,1 М СаС 1 м 34 2и 1,2 мп раствора гемоглобина (3,37 10М) в 0,01 М трис-НС 1 буфере рН 7,4 (конечная концентрация гемоглобина 2,9 1 О- М), В опытную и контрольную кюветы помещают по 2 мл реакционной смеси, прописывают на приборе Яресогд нулевую линию. Реакцию начинают добавлением в опытную кювету возрастающего количества фермента " 2,4,8,12,18 мкп (исходная концентрация ФЛА0,011 мкг/мкл). Через 10 мин записывают изменение интенсивности между максимумом и минимумом в раэностном спектре гемоглобина в каждом случае отдельно. Сразу же реакцию останавливают добавлением О,1 мп 0,25 М ЭДТУ для того, чтобы провести параллельно определение активности фермента уже известным хроматографическим способом. Для этого к содержимому опытной кюветы добавляют двойной объем смеси хлороформа с метанолом в соотношении 2:1, интенсивно встряхивают 5- 10 мнн, центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин, нижний хлороформный слой .отбирают, упаривают и.продукты реакции - ЛФХ, ФХ и жирные кислоты - разделяют с помощью тонкостойной хроматографии на силикагелевых пластинах в системе растворителей хлороформ: метанол НО (65;25:4 П 7). Пятна, соответствующие лизодимиристоилфосфатидилхолину (ЛФХ) и димиристоилфосфатидилхолину (ФХ), проявляют в парах Т, отмечают их границы, дают испариться. Пятна выскребают. Затем проводят количественное определение неорганического фосфата по методу Васьковского. К пробам добавляют 0,2 мп концентрированной НС 10 и нагревают 10 мин на песчаной бане, к остывшим пробам приливают по 4,8 мп реагента Васьковского, помещают в кипящую водяную баню на 15 мин и колориметрируют на СФпри 1 = 825 нм, Исходя иэ полученных данных строят зависимость изменения интенсивности между максимумом и минимумом (Р) в разностном спектре гемоглобина от концентрации фосфолипазы А (фиг.2) и зависимость скорости накопления продукта реакции (ЛФХ) от концентрации фосфолипазы А(фиг.З). Из этих графиков находят корреляционные. коэффициенты Ки К.,Определение К,из графика на фиг,З. Абсцисса ордината6.10 г . 7.10-э 0 85.103,5 10: 4 10 э = 0,87 10;5 10 г: 6 10= 0,83 10;Среднее значение (0,85+0,02) 10Определение Кг из графика нафиг.2.Абсцисса ордината5,10-г6,610 г; 610 г =1,1;4.10 г: 3,8.10= 1,05;2 10 : 1,8 10 = 1,1.Среднее значение 1,1,Из этих же графиков выводят1 ФЛАг 3 = К г лР = 1,1 дЭ (фиг,2);ФЛАг 3 = КА = 0,85 10 А,где А - количество продукта, образованного в единицу времени,выраженное мкМ (активности 10 15 25 30 фермента). 20 Кг 30 Отсюда К А = К д П А= ---г К 11 60 А 8,5 35 40 45 50 55 8,5 А = 1,1 Л О.П р и м е р 3. Определение активности фасфолипазы Аг.Реакционную смесь готовят как в примере 1 и 2. К 2 мп реакционной смеси в опытную кювету добавляют 1 мкл раствора фосфолипазы А г неизвестной концентрации и через 10 мин записывают изменения интенсивности между максимумом и минимумом в разностном спектре гемоглобина. Оно равно 0,0600, что согласно рассчитанной в примере 2 формулы, соответствует активности 7,7 10 э мкМ/мин. Одновременно оканчивают реакцию добавлением в опытную кювету О,1 мл 0,25 М ЭДТУ. Продукты реакции экстрагируют двойным объемом смеси хлороформа с метанолом в соотношении 2:1, встряхивают, слои разделяют центрифугированием, нижний хлороформный слой упаривают и проводят определение,количества образовавшегося продукта хроматографическим способом и количественным определением неорганического фосфорапо методу Вась- ковского. Получено при колориметрировании значение П эг =0,405 для ЛФХ, что соответствует активности фермента, равной 7,2 10 1 мкМ/мин, Из описанного следует, что при расчете активности фосфолипаэы Аг не изобретения Формул а Способ определения активностифосфолипаэы Аг, предусматривающийпроведение фосфолипазной реакциианализируемой пробы в присутствиисоли кальция и мицеллярной формысубстрата - яичного лецитина с холатом натрия с последующим измерениемколичества жионой кислоты, отщепляющейся от фосфолипида, о т л и ч а -ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа анализируемую пробу,содержащую фосфолипазу Аг, помещаютв одну из двух кювет, в которые дополнительно вводят раствор гемоглобина, соль кальция и мицеллярнуюформу субстрата, количество жирнойкислоты определяют спектрофотометрически по увеличению расстояния между максимумом и минимумом в разностном спектре гемоглобина, а активность фермента оценивают по калибровочному графику,известной концентрации предлагаемымспособом и ранее применявшимся хроиатографическим способом пслученлсравнимые значения,Определение активности фосфс:.па"зы Аг описанным споссбои по.ь.ш;отспецифичность определения, посколькуне зависит от внешних факторовТаким образом, способ отличаетсяпростотой, позволяет проводить ки-.нетические исследования непосредственно в кювете спектрофотометра,обладает высокой чувствительностьюи точностью. В ходе определения активности фосфолипазы не происходитзакисления среды, так как реакциюпроводят в буферном растворе, Определение не требует уникального оборудования.Способ может быть легко адаптирован для определения активности других липолитических ферментов, в результате действия которых освобожда-.ется жирная кислота (липаза, липопротеидлипаза и др.).Способ может найти широкое применение в биохимических исследованияхкинетических закономерностей механизма действия фосфолипазы Аг, атакже в биотехнологии для контроляактивности фермента на разных стадиях очистки при промышленном выделении иэ природных источников,Л.Бори дюкова оставител ехред Л.С едактор И.Бобков Корректор В.Бутяга каэ 6539/20 Тираж 520 Под ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5