Способ получения субкультуры клеток человека и животных

Взамен ранее изданного СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 19) (И 1(51)5 С 12 И 5/О ГОСУДАРСПО ИЗОБПРИ ГНН ВЕННЫЕТЕНИЯМ ССР КОМИТЕТОТНРЫТИЯМ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(21) 42 (22) 29 (46) 15 (71) Ин АН СССР (72) В. (53) 57 (56) яу г, 12,323/28-1307.8709.90, Бюл. Мф 34титут биологичес й физики.1 1980 т. 9 1,фологиейучьтуры альных клеток "булыжной мос помещают в те ратурой 6 С. нимают из тер просматривают трольной куль с типичнои мо овой"Затем мостат Ц ерез 24 ч куючо ст ат а-холоди под микроско уре монослай Изобретениельтивиров аниможет найти кенизмагии и относится к техни я клеток вне орга применение в биол с темпеьтуры выльника и е ом. В конклеток осество медицинЦелью изобретения является повышение жизнеспособности и сохранение нормальных функций клеток.П р и м е р 1, Эндотелиальные клет, ки аорты взРослой собаки выделяют механическим соскабливаниемих скальпе-. лем со стороны интимы. Клеточные агрегаты размельчают пипетированием в среде Игла МЕМ и центрифугируют. Клетки ресуспендируют в 1 О мп питательной среды Игла МЕМ и разливают по 5 мп в два фпакона "фапкон". Причем в один из них вносят 20% эмбрионая сыворотки коровы (контрольная культура, в другой - 20% собачей сыворотки (опытная культура), Смену питательных сред на соответствующие производят через 2"3 суток. Через 12 суток культивирования при 37 С в обоих флаконах образовался монослой эндотели(54) СПОСОБ ПАССИРОВАНИЯ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ(57) Изобретение относится к технике культивирования клеток вне организма и может найти применение в биологии и медицине. Целью из обретения является повьппение жизнеспособности и сохранение нормапьных функций клеток. Для этого клетки человека и животных куль тивируют в среде, содержащей сыворотку крови собаки, а отделение монослоя осуществляют ца холодепри температурео4 - (плюс) 6 С в течение 12-24 ч. тается прочно прикрепленным к подпожке, тогда как в культуре с 20% собачьей сыворотки монослой полностью отделяетсяот подложки и плавает в среде в виде пленки размером 57 см. После энергичной тряски флакона с клеточ-. ной пленкой и последующего пипетирования образовываются небопьшие агрегаты, содержащие в среднеи по 5-15 кпеток, которые иересеваются в свежую среду Игла с 20% собачьей сыворотки в соотношении 1:6,Часть клеток при этом используют дпя оценки их жизнеспособности посредством окраски трипацовым синим, Колич жизчеспособпых (т. е, непоглотивших краситель) клеток в исходнойсуспензии составляет 95 ., Через 4-5 чпосле помещения культуры в термостатпри 37 С практически все клетки прикрепляются к подложке и распластывают 5ся.Для отделения клеток от подложкив контрольной культуре используют0,1 -ный раствор трипсина в солевомбуфере, В результате получают суспен Овию единичных клеток, которая такжепересевается в соотношении 1;6 в среду Игла +20 . эмбриональной сывороткикоровы. Окрашивание пробы этих клетоктрипановым синим показывает, что коли чество жизнеспособных клеток не превышает 80 , а время прикрепления их кподложке и распластывания более 12 ч.Дальнейшее пассиров ание контрольной и опытной субкультур известным ипредлагаемым способом (т.е. без использования ферментов) показывает,что после четвертого пересева эндотелиальные клетки в контрольной культуре резко снижают скорость роста и сре ди них появляются аномальные гигантские клети, тогда как в опытной культуре изменений клеток по этим характеристикам не происходит, После пятогопересева клетки в контрольной культу-, ЗОре полностью дегенерируют, тогда какопытная культура пересевается восемьраз без каких-либо заметных измененийв скорости роста и морфологии,П р и м е р 2, Перевиваемые фибробласты мыши линии ЯН выращивают всреде 199+101 .бычьей сыворотки до образования монослоя. Обработкой моиослоя этих клеток раствором 0,25 трипсина получают суспенэию фибробластовв среде 199. Полученную суспензию клеток 01 Н.плотностью 35 тыс/мп помещаютв шесть Флаконов Карреля по 7 мл вкаждый,В три из них добавляют 10% бычьейсыворотки (контрольные культуры), втри других - 5 бычьей сыворотки плюс5 собачьей сыворотки (опытные культуры) и их помещают в термостат при37 фС. Периодически культуры просматри- Овают под микроскопом. В опытных культурах образование моноспоя происходит через 3,5-4 суток, в контрольных -на 4,5-5 суткиПосле образования монослоя опытные культуры помещают втермостат +4 С. Через 12 ч нахожденияпри 4"С в опытных культурах отмечаютзначительные участки отслоившегося от. подложки монослоя и после встряхиванияфлаконов происходит его полное открепление. Посредством пипетирования клеточные пленки разбивают до образованиясуспенэии агрегатов в среднем по 310 клеток в каждом. Окрашивание этойсуспензии показывает, что 98 . клетокжизнеспособны, Время их распластывания на подложке после посева в свежуюсреду составляет 1,0-1,5 ч в обоихтипах сред.В контрольных культурах отделениеклеток проводят обработкой их монослоя смесью трипсин-версена в соотношении 1:4. Количество жизнеспособныхклеток по трипановой пробе составляет82 . Время распластывания фибробластов после пересева составляет от 1,5до 2,5 ч.П р и м е р 3. Фибропласты линииВНКкультивируют до образованиямонослоя и затем обрабатывают раствором 0,25 трипсина с целью получениясуспензии единичных клеток. Полученные клетки высевались в среду ИглаМЕМ в два флакона Карреля. В одиниз них добавляют 10 бычьей сыворотки,в другой -5 бычьей сыворотки +5 сыворотки собаки, Через 3 суток вобоих культурах фибробласты образовывают монослой. Флакон с культурой,содержащей сыворотку собаки, помещают в термостат при 5 С, Через 15 чтакой инкубации происходит полное от=крепление клеток от стекла, После пипетирования и окраски трипановым синим устанавливают подсчетом, что 99 клеток являются жизнеспособными.Гнтрольная культура обрабатывается 0,25%-ным раствором трипсина. Трипановая проба показывает, что жизне-,способными являются 82 клеток,Формула иэ обретенияСпособ пассирования клеток человека и животных, включающий их выращивание в среде, содержащей сывороткукрови собаки, и последующее отделение образовавшегося монослоя от подложки, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью повышения жизнеспособности и сохранения нормальных функцийклеток, отделение монослоя осуществляют инкубацией культуры клеток на холоду при температуре 4-6 С в течение