Способ получения молокосвертывающего ферментного препарата

(088.8) Авторское свидет 0801, кл. С 12 Б торское свидетел 1288, кл. С 12 Н СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГО ФЕРМЕНТНОГО Л Изобретение може в пищевой промьпп ССР82Р льство С9/58, 1ство ССС9/58, 1МОЛОКОСЕПАРАТА пользодля избыть и енности ов. Цел тивност ения твердых я " повьнпени изцел СУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ К А ВТОРСНОМ,/ СВИД(57)ваноготоврете вого продукта и упрощение процесса за счет использования активного продуцента штамма Мсапрофитного дереворазрушающего базидиального гриба НгзсЬюрогиз 1 аг 1 с 1 пцз ВКПМ Р, культивируемого на глюкоэопептонной среде, охлаждения ее до температуры 4-5 С, осаждения фермента сернокислым аммонием при 55-803-ном насыщении с последующей его очисткой от низкомолекулярных веществ и белков, не растворимых в,воде, методом г ализа против охлажденной дистилл рованной воды при температуре 4-5 С и дальнейшей очисткой фермента методом электрофореза в параллельных пластинках полиакриламидного геля. Актив/ ность ферментного препарата1700 000 ед/г.Изобретение относится к производству ферментных препаратов, в частности молокосвертывающего Фермента,путем культивирования сапрофитногодереворазрушающего базидиального гриба НгвсЬорогив 1 аг 1 спця (Кагвг)КуЦ.на жидкой питательной среде. Полученный ферментный препарат можетбыть использован в качестве заменителя сычужного фермента - реннина,при производстве твердых сыров,Целью изобретения является повьшение активности целевого продукта иупрощение процесса. 15Способ состоит в следующем.Итамм Н 1 гвсМорогив 1 аг 1 спшв ВКПМР(М) культивируют на каждойпитательной среде следующего состава,г/л: 20Глюкоза 10,0Пептон 3,0К НРО 4 0,4КН РО 4 0,6М 880, 7 Н,О 0,5 25ЕпЯОе 7 Н О О, 001СаС 1 0,05Дистиллированная вода до 1 л.Питательную среду разливают в конические колбы и стерилизуют в автоклаве под давлением 1 атм в течение40 мин, Кислотность среды после стерилизации составляет 4,5-5,5 рН, Посевной мицелий выращивают на агаризированной глюкоэокартофельной среде, 35сусло-агаре и на жидкой питательнойсреде. Инкубируют штамм Мв термостате ТСМ при 30 С.Максимальная молокосвертывающаяактивность у штамма Мна среде с 40глюкозой наблюдается на 10-15 сутроста, затем несколько снижается и к30 сут падает в 3 раза,Осаждение белков по Фракциям из культурального фильтрата осуществляют путем увеличения концентрации серно- кислого аммония на 10%, Фракцию бел" ка, выпавшую в осадок, отцентрифугировывают на рефрижераторной центрифуге в течение 15 мин при 4-5 С ио 50 подвергают первичной очистке с помощью диализа против охлажденной дистиллированной воды в холодильнике в течение 18 ч. В качестве полупрони-: цаемой мембраны используют целлафановую пленку, поры которой пропускают вещества с молекулярным весом до 7000-10000,Белки, обладающие молокосвертывающей активностью, подвергают дальнейшей очистке с помощью метода электрофореза в параллельных пластинках полиакриламидного геля. Полученный водорастворимый белок вносят в количестве О, 1 мп в каждую ячейку верхнего геля, Их в приборе 46. Для электрофоретического разделения белков исполь" зуют 7,5%-ный щелочной гель. В щелочном геле белки мигрируют к аноду, поэтому нижний электрод камеры подключают к гнезду выпрямителя (УИП), имеющему знак плюс(+). Верхний электрод присоединяют к знаку минус (-), В начале электрофореза, до вхождения индикаторной краски в разделяющий гель, поддерживают ток 80 мА при напряжении 210 В, Затем повышают ток до 180 мА при напряжении 470 В. Заканчивают фракционирование белков при подходе индикаторной краски к нижнему краю разделяющего геля. Злектрофорез длится примерно 3 ч. Затем сняв боковые стеклаприбора, срезают концентрирующий гель и вынимают из кювет пластинки разделяющего геля. Для определения электрофоретической подвижности молокосвертывающего Фермента отрезают три ячейки разделяющего геля и Фиксируют 7%-ным раствором трихлоруксусной кислоты в течение 20 мин. Затем отмывают гель от трихлоруксусной кислоты дистиллированной водой (трижды по 1 О мин) и окрашивают в течение ночи в 0,02%-ном растворе красителя Кумасси ярко-голубой Г, приготовленного в смеси этиловый спирт - вода - уксусная кислота (10;30:1). Избыток красителя отмывают раствором, состоящим их этой же смеси растворителей. Отмытый от красителя гель используют для определения относительной электрофоретической подвижности зон молокосвертывающего Фермента и служит эталоном для выявления локализации фермента в пластинках геля, не подвергшихся Фиксации и окраске красителем, Отмытый гель накладывают на пластинки разделяющего геля и отмечают место нахождения зон молокосвертывающего фермента, которые вырезают, объединяют, замораживают и растирают в ступкеРастертую массу заливают холодной дистиллированной водой для экстракции белков, которая длится в течение 2- 3 ч, Затем гомогенат центрифугируют3139 в центрифуге (8000 об/мин) при 4-5 С в течение 15 мин. Надосадочную жидкость сливают и подвергают лиофильной сушке. Полученный препарат имеет вид порошка светло-кремового цвета, хорошо растворимого в воде. Молокосвертываищая активность этого препарата составляет 1700000 ед/г.П р и м е р. Выращивание штамма Мосуществляют в конических колбах на 1 л, содержащих 300 мл стеральной глюкозопептонной среды с рН 4,5-5,5 в термостате при 30 С поверхностным способом в течение 10 сут. Культуральный Фильтрат отделяют от мицелия путем фильтрования через бумажный Фильтр (синяя лента). Затем фильтрат охлаждают в холодильнике до 4 С и осаждают Ферментный препарат сернокислым аммонием, Молокосвертывающий фермент находится во Фракции белка, осаждаемой от 55 до 80%-ного насыщения фильтрата сернокислым аммонием. Выпавший в осадок белок центрифугируют и диализируют против охлажденной дистиллированной воды в холодильнике в течение 18 ч. Затем диализируемую смесь переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют при 8000 об/мин в течение 15 мин. Полученная надосадочная жидкость содержит молокосвертывающий Фермент, которьп подвергают дальнейшей очистке методом электрофореза в параллельных пластинах полиакриламидного геля.Надосадочную жидкость сливают и подвергают лиофипьной сушке. Полученный препарат имеет вид порошка светло- коричневого цвета, хорошо растворимого в воде. Молокосвертывающая активность этого препарата составляет 1700000 ед/г. Молокосвертывающая активность ферментного препарата определяют по методике, предложенной Каваи и Мукаи. Для этого в 100 мп натурального молока вносят 1 мл 15 -наго раствора СаС 1 , тщательно перемешивают и доводят кислотность субстрата с помощью 10 -ного раствора НС 1 до 6,0-6,1 рН. Затем берут по 10 мп молока в пробирки и нагревают в водяной бане доо35 С. После этого в каждую пробирку . добавляют 1 мл 0,1 -ного водного раствора Ферментного препарата. Смесь в пробирках встряхиваюти снова стаовят в водяную баню при 35 С. В момент встряхивания пускают секундомер 56724и начинают отсчет времени, которьязаканчивают при появлении в пробиркахплотного сгустка. Время, затраченноена образование сгустка, условно считают молокосвертывающей активностью,выраженной в минутах,За единицу молокосвертывающей активности принимаютколичество Фермента, необходимое длясвертывания 100 мл молока за 40 минопри 35 С и рассчитывают по Формуле,40 100 фКМСА = ----ед/гпрепаратагде К - коэффициент разведения препа рата фермента;С - время, в течение которого из100 мл молока при добавлении1 мл, 0,1 -ного раствора фермента образуется плотныйсгустокр мин40 - среднее время свертывания молока при производстве сыра,ос - навеска ферментного препара та, в г.Для осаждения молокосвертывающегофермента из культурального Фильтратаиспользуют сернокислый аммоний; обладающий стабилизирующим действием наферменты и все операции по вьщелениюи очистке молокосвертывающего препарата не требуют отрицательных низкихтемператур.Культуральный Фильтрат штамма М НгвсМорогив 1 агсыыв патогенными 35токсичными свойствами по отношению кбеспородным белым мьппам обоего полане обладает.1 4 О Формула изобретенияСпособ получения молокосвертывающего ферментного препарата, предусматривающий поверхностное культивирование продуцента НдгвсЬорогцв 1 аг 1- 4 споз ВКЛМ Рна глюкоэопептоннойпитательной среде до достижения максимальной активности, отделение мицелия фипьтрованием, осаждение фермента сернокислым аммонием и очистку, 5 О о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью повышения активности целевогопродукта и упрощения процесса, фильторат охлаждают до 4-5 С, осаждение ведут при 55-80 -ном насьпцении, а очи стку - сначала диализом против охлажденной дистиллированной воды при 4 о5 С, затем методом электрофореза впараллельных пластинах полиакриламидного геля.