Способ получения молокосвертывающего ферментного препарата руссулин

Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ и 1883174(5). л. С 12 Й 9/50// А 23 С 19/032 Гооударатвеннцй квинтет во девок изобретений и открытий(53) УДК 576.5. .08(088.8) Дата опубликования описания 23, 11,8 ФВ. М. Гуцапюк, В, Р. Кулинченко, М, Н.11 удьга )Е. Е, Каталевский, Н. П. Круглова, П. 1;1 Евтихов,А. Е, Епифанов и П, Н, Ручков 1 1- -. )В 11 ВДн,;Киевский технологический институт пищевой промышленности(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОЛОКОСВЕРТЫВАЮЩЕГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА РУССУЛИНИзобретение относится к производству микробиальных заменителей сычужного фермента для сыродельной промьпдленности,Известен способ получения фермента медицинского назначения Руделина, пре-дусматривающий культивирование продуцента Воззц 1 а с 1 есо 1 огапз (штамм 2) на жидкой питательной среде, в состав которой вводят 5,0-20 г/л кукурузной муки. После осаждения эталоном белко-.0 вый раствор смешивают с фракционированной микрокристаллической целлюлозои из расчета 8,5-11,5 г/л и фильтруют с использованием нетканых материалов из полипропилена, а фильтрат под 15 вергают ультрафильтрации 11 1. Недостаток известного способа - сложность технической схемы обуслов 30 ленная необходимостью получения высоко. активного препарата, а также низкая эффективность процесса ультрафильтрации водных экстрактов фермента. Наиболее близким к предлагаемомупо технической сущности является способ получения молокосвертывающего ферментного препарата Руссулин, предусматривающий культивирование его продуцента Ъззц 1 а десо 1 огапз (штамм 2) нажидкой питательной среде, содержащейисточники углерода, азота, необходимые минеральные соли в условиях аэрации с последующим выделением целевогопродукта из фильтрата культуральнойжидкости и его сушкой 121.Недостаток известного способа -его низкая эффективность и небольшойвыход фермента.Целью изобретения является упрощение способа и увеличение выхода фермента,Поставленная цель достигается тем,что согласно способу, предусматривающемукультивирование его продуцентаВцззц 1 а АесЬогапз (штамм 2) на жидкой питательной среде, содержащей исФточники углерода, азота, необходимыеминеральные соли в условиях аэрации с последующим выделением целевого продукта из фильтрата культуральной жидкости и его сушкой, выделение фермент- ного препарата проводят путем ультра- фильтрации фильтрата культуральной жидкости до содержания сухих веществ 4-67 с последующей распылительной сушкой ультраконцентрата при рН 5,0- 5,5, причем для мембран на основе аце О тата целлюлозы рН ультрафильтрации устанавливают 5,5-5,7,Кроме того, при содержании фермента в грамме сухих веществ фильтрата культуральной жидкости 30-60 тыа. ед, полученный ультраконцентрат диафильтруют водой с рН, равным рН ультраконцентрата, до удельной активности фермента 125-30 тыс. ед,/г с последующей ультрафильтрацией диаконцентрата или его непосредственной подачей на сушку.Технология способа состоит в следующем.Культура высшего базидиального гриба Кцззца бесоогапз (штамм 2) выра - щивается на питательной среде, содержащей, 7,: кукурузная мука 1,0-1,8; гидролизные дрожжи 0,2-0,3; калий хлористый 0,1; калий Фосфорнокислый однозамещенный 0,4-0,06; калий фосфорнокислый двухзамещенный 0,02-0,)4; магний сернокислый 0,05-0,07; натрий азотнокислый 0-0,3; рН питательной следы 5,3-5,5, температура Ферментации 25-26 С, избыточное давление 0,03- 0,05 МПа, подача стерильного воздуха в количестве 0,5 объема на один объем среды в минуту. Продолжительность процесса ферментации 110 в 1 ч.После ферментации получаем культуральную жидкость с грибным запахом, светло-коричневого цвета, имеющую во взвещенном состоянии гифы мицелия гриба в виде шариков или нитей различной величины в количестве 4-7 г/л, рН 3,5- 5,0; молокосвертывающая активность ф 5 МА) 400-200 ед/мл. Культура гриба охлаждается до 18-20 С и освобождаетося от мицелиальной массы фильтрацией через плотную ткань типа "бязь". Отделенную от культуральной жидкости 50 биомассу сушат с целью ее дальнейшего использования в сельском хозяйстве, а фильтрат подвергают очистке от взвешенных частиц сепарированием с последующей его холодной стерилизацией через асбестоцеллюлозные пластины марки СФ, причем для мембран на основе ацетата целлюлозы например, полимер 55 883174ные пленки типа "Владипор" марки УАМ 100) перед сепарированием фильтраткультуральной жидкости доводят концентрированным раствором МаОН до рН5,5-5, 7.Фильтрат культуральной жидкостипосле предварительной обработки с содержанием сухих веществ 0,4-0,6 .,ХПК 1300-1500 мгО /л подают на ультрафильтрацию через полупроницаемыемембраны, на 98-1007. задерживаюшиемолекулы фермента Руссулин, напримермембраны марки УАМ, Во избежаниетермической инактивации фермента температура Фильтрата культуральной жид-,кости в процессе ультрафильтрацииподдерживается равной 8-20 оС,Ультрафильтрацию проводят до содержания сухих веществ 4-67. Пои этом вультрафильтрат проходит 95-987 всегообъема фильтрата культуральной жидкости, 50-707 низкомолекулярных соедине-.ний и балластных белков, в результатечего удельная активность фермента возрастает в 2-3 раза.Если начальное содержание ферментав грамме сухих веществ фильтрата культуральной жидкости 60-100 тыс. ед/г,ультраконцентрат доводят ледяной уксусной кислотой или концентрированнымраствором едкого натра до рН 5,0-5,5и подают на распылительную сушку с температурой на входе 120-130 С на выхооде 60-70 С, причем ультраконцентрат,полученный на ацетатцеллюлозных мембранах подается на сушку непосредственно после ультрафильтрации. После сушки получают мелкодисперсный, однородный порошок светло-коричневого цвета,1 г которого растворяется в течение1 О мин в 100 мл воды при 35 С, чтоосоответствует требованиям, предъявляемым сыродельной промьппленностбю кмикробиальным заменителям сычужногофермента. Препарат станпартизуют поваренной солью до ИА 00 + 5 тыс. ед/а ультрафильтрат, имеющий ХПК 400500 мгО/л и СВ 0,3-0,67., частичноиспользуют для приготовления исходнойпитательной среды или подают на биологическую очистку.Если начальная удельная активностьфильтрата культуральной жидкости составляет 30-60 тыс. ед/г, полученный,ультраконцентрат диафильтруют водойс рН, равным рН ультраконцентрата,до удельной активности Фермента 125130 тыс, ед/г. Диаконцентрат дополнительно ультрафильтруют до СВ 4-6750 с последующим доведением рН до 5,05,5 и подачей на сушкуили непосредственно подают на сушку после доведения рН, а диафильтрат и оба ультраФильтрата смешивают (ХПК смеси 350- 5450 мг 02/л, СВ 0,3-0,57.) и используют частично для приготовления исходной питательной среды или подают набиологическую очистку,В таблице приведены данные по выходу промежуточных продуктов по стадиям получения ферментного препаратаРуссулин с применением методов осаждения и ультрафильтрации.Как видно из таблицы, применениеультрафильтрации с последующей распылительной сушкой ультра- или диаконцентрата упрощает технологию получения ферментного препарата и существенно увеличивает его выход по 20МА.П р и м е р 1. Культура грибаЮ ззц 1 а десо 1 огапз (штамм 2) выращи. вают на питательной среде, содержащей 7,кукурузная мука 1,8; гидролизные Ндрожжи 0,3; калий Фосфорнокислый однозамещенный 0,06; калий фосфорнокиспый двузамещенный 0,04; магний сернокислый 0,05; калий хлорстый О,1; натрий азотнокислый 0,2. 30оФерментацию проводят при 25 С втечение 140 ч, избыточное давление0,05 МПа, подача стерильного воздухав количестве 0,5 объема на один объем среды в минуту. Полученную культу- з 5оральную жидкость охлаждают до 18-20 Си отделяют от нее мицелий гриба. Отделенную от культуральной жидкостибиомассу сушат, а фильтрат доводят303 раствором йаОН до рН 5,7 и подают 0,на сепарирование с последующим егоьсветлением и холодной стерилизациейчерез асбестоцеллюлозные пластины марки СФ. Выход фермента на стадии предВаритейьной обработки культуральной 45жидкости 923.310 л фильтрата культуральной жидкости с рН 5,7; СВ 0,57.; МА 360 ед/мп(удельная МА 72 тыс. ед/г), ХПК1320 мгС/л подают на ультрафильтрацию через ацетатцеллюлозные мембваныс. эффективным диаметром пор 100 А.В процессе ультрафильтрации температура фильтрата культуральной жидкостиоподдерживается равной. 18-20 С, Ульт-.рафильтрацию проводят до 4,2 Х СВ. Приэтом в ультрафильтрат проходит 953начального объема фильтрата культуральной жидкости, 587 низкомолекулярных веществ и балластных белков. В результате получают 15,5 л ультраконцентрата с МА 6480 ед/мп (удельная МА 154 тыс, ед/г), рН 5,5. Выход фермента на стадии ультрафильтрации 903. Ультраконцентрат подают непосредственно на распылительную сушку с температурой на входе 125 ОС, на выходе 65 С. После сушки получают 573 г ферментного препарата с МА 124 тыс. ед/г, 1 г которого в течение 10 мин растворяетсяов 100 г воды при 35 С. Выход фермента на стадии сушки 7057; общий выход 587., выход ферментного препарата по весу в пересчете на стандартную активность 2,3 г/л культуральной жидкости, Дпя получения стандартной активности к полученному препарату в качестве наполнителя добавляют 110 г поваренной соли. Ультрафильтрат в количестве 294,5 л с содержанием сухих веществ 0,37 и ХПК 440 мгО/л направляют на биологическую очистку.П р и м е р 2. 80 л прошедшего предварительную обработку ( выход фермента на стадии 927) фильтрата культу" ральной жидкости Руссулина с рН 5,6; СВ 0,67; МА 250 ед/мп ( удельная МА 42 тыс. ед/г), ХПК 1450 мг Од/л подают на ультрафильтрацию через ацетатцеллюлозные мембраны с эффективнымодиаметром пор 05 А. В процессе ультрафильтрации температуру Фипьтрата культуральной жидкости поддерживаюторавной 18 - 20 С. Ультрафильтрацию проводят до 5,6 Х СВ. При этом в ультрафильтрат проходит 967 начального объема фильтрата культуральной жидкости, 637 низкомолекулярных веществ и балластных белков. В результате получают 3,2 л ультраконцентрата с МА 5950 ед/мп (удельная МА 106 тыс. ед/г), рН 5,5 и 76,8 л ультрафильтрата с СВ 0,397 ХПК 420 мгО/л. Выход фермента на стадии ультрафильтрации 953. Ультраконцентрация 10 л воды, доведенной до рН 5,5, диафильтруют до содержания фермента в грамме сухих веществ 130 тыс. ед:, при этом содержание сухих веществ в диаконцентрате снижается до 4,5 Ж. Выход Фермента на ста- дии диафильтрации 987. Диафильтрат подают непосредственно на распыпительную сушку (получают 137 г препарата с МА 103 тыс, ед/г, выход Фермента на стадии сушки 767) или дополнительно ультрафильтруют до СВ 5,6 Х. После дополнительной ультрафильтрации получают 2,5 л ультраконцентрата и О, 7 л-9 7-93 Предварителперед ульт (отделениесепарирова бработкрацией цели иба 95-92 ветле Вакуум-выпариванита культуральной е филь 90-80 кос льтра- и диафил ильтрата культу жидкости траци нои-70 Стандартизация, Фасовка и упаковка готового продукт 98 67-5-30 9-9 р и м е ч а н и е: Данные по выходу промежуточных продукттоосажденного ферментного препарата взяты из опытно-промышламента на производство ферментного препарата Ренниноруссули Х, И., 1979,енног реГ ультрафильтрата ( выход Фермента настадии дополнительной ультрафильтрации987.7. Ультрафильтрат подают на распылительную сушку, в результате которойполучают 126 г ферментного препаратас МА 105 тыс, ед/г (выход ферментана стадии сушки 727), а диафильтрат иоба ультрафильтрата смешивают (ХПКсмеси 390 мг 02 /л, СВ 0,387) и направляют на биологическую очистку, Общий 16выход фермента 657 (с дополнительной 74 8ультрафильтрацией бОЙ), выход фермент- ного препарата по весу в пересчете на стандарную активность составляет 1,7 г/л культуральной жидкости.Применение ультрафильтрации с последующей распыпительной сушкой ульт" раконцентрата в технологии получения молокосвертывающего ферментного препарата Руссулин позволит увеличить выход фермента и снизить затраты на его производство3174 10тата целлюлозы рН ультрафильтрацииустанавливают 5,5-5,7.2, Способ по п. 1, о т л и ч а -ю щ н й с я тем, что при содержаниифермента в грамме сухих веществ фильтрата культуральной жидкости 30 -60 тыс. ед., полученный ультраконцентрат днафильтруют водой с рН, равнымрН ультраконцентрата, до удельной ак- О тивности фермента 125-130 тыс, ед./гс последующей ультрафильтрацией диаконцентрата или его непосредственнойподачей на сушку.Источники информации 5 принятые во внимание при экспертизе1. Авторское свидетельство СССРпо заявке В 2794095/28-13,л. С 12 М 9/50, 1979.2. Авторское свидетельство СССР Ю Ф 522230, кл. С 12 0 13/1 О, 1972(прототип). 88 формула изобретения 1. Способ получения молокосвертывающего ферментного препарата Руссулин, предусматривающий культивирование его пррдуцента Воззо 1 а десо 1 огапз (штамм 2) на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота, необходимые минеральные соли в условиях аэрации с последующим выделением целевого продукта иэ фильтрата культуралъной жидкости и его сушкой, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа и увеличения выхода фермента, выделение ферментного препарата проводят путем ультрафипьтрации фильтрата культуральной жидкости до содержания сухих веществ 4-6 Х с последующей распылитепьной сушкой ультраконцентрата при рН 5,0- 5,5, причем для мембран на основе ацеТираж 531 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская нвб д. 4/5